生物学茶話＠渋めのダージリンはいかが８８ トランスポゾン２

今回はトランスポゾンの種類や構造について述べます。細菌から私達人類まで、あらゆる生物はファージ（バクテリオファージ＝細菌に感染するウィルスなので、広義のウィルスの範疇に含まれると考えてよい）やウィルスの脅威にさらされています。しかしファージは細胞に感染するとすぐに増殖して細胞を破壊するようなタイプのものばかりではなく、なかにはホストのＤＮＡに組み込まれてプロファージの状態となり、あたかもホストのＤＮＡの一部であるように振る舞うタイプもあります（１）。

すなわち太古の昔から、素性の知れない外界ＤＮＡをホストのＤＮＡの中に埋め込む生化学的システムは存在したと考えられます。そのために必要な最小限のメカニズムには、ホストのＤＮＡと親和性を持った塩基配列、ホストのＤＮＡに切れ目を入れるエンドヌクレアーゼ活性、ホストのＤＮＡと接続するためのＤＮＡリガーゼ活性などが含まれているはずです。

ホストのＤＮＡに埋め込まれたウィルスのＤＮＡの一部に突然変異が生じて、例えば殻のタンパク質をコードする遺伝子が使えなくなってしまったらどうなるでしょう。もはやウィルスはホストの外では活動できません。ただＤＮＡを切り出したり、埋め込んだりする活性が残っていればホストのＤＮＡの中で移動することは可能かもしれません。

真核生物の場合は、このようなＤＮＡを遺伝物質として持つウィルス以外に、ＲＮＡを遺伝物質として持つレトロウィルスが感染する場合があります。この場合レトロは「昔の」という意味ではなく、「逆の」という意味です。普通の生物がやっているＤＮＡからＲＮＡへの転写ではなく、レトロウィルスはＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素によりＤＮＡを合成する（＝逆転写）ことができます。

レトロウィルスとは、ヒトに感染するものではインフルエンザウィルス、ＨＩＶ、はしかウィルス、ムンプス（おたふくかぜ）ウィルス、Ｂ型以外の肝炎ウィルスなどがそうです。この場合も逆転写されたＤＮＡがたまたまホストのＤＮＡに組み込まれてプロウィルスの状態になることがあります。

プロウィルスとなっても細胞に感染するための遺伝子が変異して役立たなくなることはあり得ます。このように感染力を失ったウィルスは、本来持っていた　１）細胞に外から感染するシステム、２）遺伝子を殻内部にパッケージングするためのシステム、３）遺伝子を包む殻、４）細胞を破壊するためのシステム　などに関連する多くの遺伝子はすべて正常であっても、感染できないという意味で結果は同じになるので、最初に変異した遺伝子以外の上記の遺伝子にも全く選択圧力がかからなくなり、荒れ放題（変異放題）となります。

ただしホストの細胞内でずっと遺伝子を残す手立てはあります。たとえば細菌や一部の真核生物の場合はプラスミドとなって、ずっと細菌体内で存続することができます。細菌のＤＮＡに組み込まれた状態でも、そのまま存続できる場合があります。すなわち他のすべての遺伝子を失っても、ＤＮＡを切り出す活性とＤＮＡに組み込む活性が保存されていれば、ホストのＤＮＡを移動することができますし、切り出されている間にＤＮＡを複製して増殖することすら可能です。哺乳類の場合、プラスミドとして生き残るものは多分ないと思いますが、ホストＤＮＡの一部としては世代を超えて残留することができます。

細菌のトランスポゾンはすべてＤＮＡトランスポゾンですが、真核生物のトランスポゾンにはＤＮＡトランスポゾンとレトロトランスポゾンが存在します。まずＤＮＡトランスポゾンからみていきましょう（２、図１）。

ＤＮＡトランスポゾンには両端にダイレクトリピート（ＤＲ）という同方向を向いた反復配列がある場合があります。これはターゲットのＤＮＡにトランスポゾンを挿入する際に使われると考えられます。ダイレクトリピートの内側にＩＴＲ（inverted terminal repeat）、またはＴＩＲ（terminal inverted repeat）という逆向きの反復配列があります（図１）。これは図３であらためて説明しますが、トランスポゾンのＤＮＡを切り出すときに認識する配列です。

これらの反復配列以外に、ＤＮＡトランスポゾンはＤＮＡトランズポゼースの遺伝子をもっており、この他にこの遺伝子を転写するために必要な配列があれば、最小限の構成を確保できます（図１）。なお図１の塩基配列は１例であり、実際の配列とは関係ありません。実例についてもっと詳しく知りたい方は文献（３、４）などが参考になると思います。

細菌のトランスポゾンはＤＮＡトランズポゾンですし、植物の中には稲のようにゲノムの大部分がＤＮＡトランスポゾンで構成されているものも多いと思われるので、おそらく世界で一番多い遺伝子は「ＤＮＡトランスポゼースの遺伝子」でしょう。ＤＮＡトランスポゾンには図２のように２つのタイプがあり、ひとつは二重鎖ごとカットして他の部位にペーストする移動型、いまひとつは一重鎖のみ切り出して、複製して二重鎖としてから他の部位に挿入する複製型です。複製型の場合、切り出された一重鎖の部分は残された鎖を鋳型としてホストの酵素で複製されるので、結果的にコピー＆ペーストとなり、トランスポゾンが２倍に増幅されます。

Inverted terminal repeat ( ＩＴＲ ) がＤＮＡトランスポゾンの両端にあることは、ＤＮＡトランスポゼースの作用機構と密接な関連があります。図３のようにＤＮＡトランスポゼースはダイマーとしてそれぞれがＩＴＲを認識して働く、すなわちＤＮＡを切断するので、ＩＴＲがトランズポゾンの両端にあることは都合が良いのです。このことはトランスポゾンのエリアを２つのＩＴＲにはさまれた部分という認識を酵素が行う上でも重要です（５）。図３右図はプロテイン・データバンク・ジャパンのイラストです。ＤＮＡトランスポゼースとＤＮＡの関係を３Ｄで表現したものです。

ＤＮＡトランスポゾンをＤＮＡに挿入するときに、ギャップができることがわかっており、ここがダイレクトリピート（ＤＲ）あるいはターゲット・サイト・デュプリケーション（ＴＳＤ）と呼ばれるサイトと考えられています（５）。この部分は当然修復されＤＮＡの接続（ライゲーション）が行われなければなりません。

図４にみられるように、トランスポゾンが挿入されたあと、ホストの細胞が持っている酵素によってギャップは修復されます（６）。修復された部分はトランスポゾンの両端に存在し、同じ方向を向いた同じ配列となります（ダイレクトリピート）。次にこの位置のトランスポゾンを切り出すときに、ダイレクトリピートを置いていくと、ＤＮＡ上に昔トランスポゾンがあったという痕跡が残りますし、持ち出すとダイレクトリピート付きのトランスポゾンができます。

ここまでＤＮＡトランスポゾンについて述べてきましたが、トランスポゾンにはもうひとつレトロトランスポゾンというジャンルのものがあります。これはＤＮＡの一部が別の位置に移転するという結果は同じなのですが、メカニズムはまったく異なります。細菌にはこのタイプのトランスポゾンはみられず、真核生物だけに存在するものです。レトロトランスポゾンの場合、普通の遺伝子のようにいったんＲＮＡに転写され、そのＲＮＡを鋳型として逆転写によってＤＮＡが合成され、さらにその単鎖ＤＮＡを鋳型として二重鎖ＤＮＡが合成され、ホストのＤＮＡに埋め込まれます（７、図５）。

大変複雑なように見えますが、実はありふれたウィルスであるインフルエンザウィルス、ＨＩＶ、Ｂ型以外の肝炎ウィルス、おたふく風邪ウィルス、はしかウィルスなどはみんな遺伝子はＲＮＡの形でホストに感染し、ホストの細胞の中で逆転写によって相補的なＤＮＡを合成してホストＤＮＡにプロウィルスという形で埋め込まれた状態で潜伏し、転写によって遺伝子ＲＮＡと必要なタンパク質を合成してウィルス粒子を作り、ホストを破壊して外に出るという生活史を繰り返します。

細菌のプロファージの場合と同様、ホストのＤＮＡに必要な遺伝子のセットを埋め込んだまではいいものの、その一部が壊れてしまったらどうなるでしょう。ウィルス粒子を作って他の細胞に感染することができなくなるので、プロウィルスのままホストのＤＮＡにとどまるしかありません。いったんとどまってしまったら、プロウィルスとして存在するための遺伝子を除いて、他の遺伝子は壊れ放題になってしまいます。そうなるとプロウィルスは原型をとどめないトランスポゾンとなってしまいます。これをレトロトランスポゾンといいます。

レトロトランスポゾンの中で、一番ウィルスの原型をとどめているのはＬＴＲ型レトロトランスポゾンで、図６に示すように、両端にＬＴＲ（long terminal repeat）という構造を持っています。ロングと言っても数百から数千塩基対というバラエティーがあって、その機能は十分には解明されていませんが、レトロウィルスはこの部位を利用してホストＤＮＡに逆転写したＤＮＡを組み込んでいることは間違いなさそうです（８）。

そのレトロウィルスの機能を使ってトランスポゾンをホスト内部で移動させようというのが、ＬＴＲ型レトロトランスポゾンです。このトランスポゾンは内部にエンドヌクレアーゼ（ＤＮＡを切断する酵素）と逆転写酵素（リバーストランスクリプターゼ）の有効な遺伝子を保存していますが、他の構造タンパク質などの遺伝子（gag、env など）は変異して無効になっています（図６）。

そのウィルスの遺産であるＬＴＲを失った長鎖トランスポゾンをＬｉｎｅ（long interspersed nuclear elements）といいます。ＬＴＲのかわりにやや長いＴＳＤがあり、さらに長い非翻訳領域が３’と５’の両端にＴＳＤに続いて存在し、何らかの形でＬＴＲのかわりにトランスポゾンのＤＮＡ組み込みのメカニズムにかかわっていると思われます。ＬｉｎｅはＬＴＲ型と同様内部にエンドヌクレアーゼとリバーストランスクリプターゼの遺伝子を持っており、それゆえに短くはなれません。だいたい４，０００～１０，０００塩基対（ｂｐ）となっています。

これに対してＳｉｎｅ（short interspersed nuclear elements）はＬＴＲのみならず、内部のエンドヌクレアーゼとリバーストランスクリプターゼの遺伝子も失っており、そもそもレトロウィルスを起源とするものかどうかも定かではありません。内部にｔＲＮＡ、５ＳｒＲＮＡ、７ＳＬ－ＲＮＡなどの機能ＲＮＡの一部に類似した塩基配列を持っており、３’末にはＬｉｎｅと相同な配列とポリＡテイルがあります。おそらくレトロウィルスとは関係なく二次的に発生したものなのでしょう。転移するための酵素がないので、Ｌｉｎｅなどが持っている酵素の支援がなければ転移することができません。構造に大きなバラエティーがあるのも特徴です（９）。

霊長類は霊長類にしかないＡｌｕエレメントというＳｉｎｅの１種を持っています。Ａｌｕエレメントという名は、Ａｌｕという制限酵素で切断される部位があることから名付けられました（図８）。ヒトの場合、全ゲノムの１１％がＡｌｕエレメントだとされています（１０）。なぜこんなに大量の特殊なトランスポゾンがヒトのゲノムにあるのかは謎です。このトランスポゾンは７ＳＬ－ＲＮＡという、タンパク質を細胞外に分泌するためのメカニズムの一翼をになうＲＮＡの遺伝子と共通な配列の断片を数多く持っています（図８）。

図８に両者のフルシーケンスを示しましたので、目をこらして比較してみて下さい。Ａｌｕエレメントを発見したのは、カール・シュミット（Carl W. Schmid ）とプレスコット・ダイニンジャー（Prescott Deininger）　（１１、図８）ですが、こんな特殊なトランスポゾンがヒトのゲノムに大量にあるとわかって、さぞかしびっくりしたことでしょう。

さまざまな生物のなかには、ＤＮＡトランスポゾンを多く持つグループとレトロトランスポゾンを多く持つグループがあります（１２、図９）。この中で注目したいのは、Entamoeba histolytica という哺乳類に感染する赤痢アメーバはレトロトランスポゾンを圧倒的に多く持っている一方で、Entamoeba invadense という爬虫類に感染する赤痢アメーバはＤＮＡトランスポゾンが圧倒的に多いという研究結果です。

つまりトランスポゾンが蔓延するために要する期間は、進化のスケールで考えるとかなり短いのではないかということが示唆されています。

実際ショウジョウバエのＰエレメントというＤＮＡトランスポゾンは、ほとんどの自然界のハエが持っているにもかかわらず、古くから飼い継がれている実験用のハエにはどれにも全くみられないということが知られており、この場合数十年の内にＰエレメントが自然界で蔓延したと思われます（１３）。

参照

１）https://ja.wikipedia.org/wiki/%E3%83%97%E3%83%AD%E3%83%95%E3%82%A1%E3%83%BC%E3%82%B8

２）Transposons: Mobile DNA
http://grupo.us.es/gfnl/dna/genetic_ingeniering/transposons.htm

３）  Kosuke Yusa, piggyBac Transposon., Microbiolspec, vol. 3 no. 2  (2015)　doi:10.1128/microbiolspec.MDNA3-0028-2014
http://www.asmscience.org/content/journal/microbiolspec/10.1128/microbiolspec.MDNA3-0028-2014

４）Narayanavari SA, Chilkunda SS, Ivics Z, Izsvák Z., Sleeping Beauty transposition: from biology to applications., Crit Rev Biochem Mol Biol.  vol.52, no.1, pp. 18-44. (2017) doi:

10.1080/10409238.2016.1237935. Epub 2016 Oct 4.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27696897

５）JD Watson, Molecular Biology of the Gene., 6th edn., pp.334-370, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2008)

６）Jennifer McDowall, Transposase.
http://www.ebi.ac.uk/interpro/potm/2006_12/Page1.htm

７）https://en.wikipedia.org/wiki/Retrotransposon

８）http://what-when-how.com/molecular-biology/long-terminal-repeats-molecular-biology/

９）http://sines.eimb.ru/Help.html

１０）Prescott Deininger, Alu elements: know the SINEs.,  Genome Biol. 2011; vo. 12(12): pp. 236-248. Published online 2011 Dec 28.  doi:  10.1186/gb-2011-12-12-236

１１）Schmid CW, Deininger PL  "Sequence organization of the human genome". Cell. 6: 345–358. (1975)
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3334610/

１２）Leslie A. Pray, Transposons: The Jumping Genes, Nature Education vol.1(1), p. 204 (2008)
https://www.nature.com/scitable/nated/article?action=showContentInPopup&contentPK=518

１３）https://ja.wikipedia.org/wiki/%E3%83%88%E3%83%A9%E3%83%B3%E3%82%B9%E3%83%9D%E3%82%BE%E3%83%B3　（具体例のセクションを参照）

生物学茶話＠渋めのダージリンはいかが８７： トランスポゾン１

トランスポゾンとは染色体上での位置を変えることができるＤＮＡ断片のことですが、発見したのはバーバラ・マクリントックという女性科学者です（図１）。

彼女は１９０２年の生まれで日本では明治の末期ですが、当時は米国でも女性が科学者になるのはまれなことでした。実際コーネル大学の農学部に進学したのですが、希望した植物育種学科は女人禁制で、大学院も遺伝学は女性は専攻できなかったので、やむなく植物学を専攻することになりました。

マクリントックが最初に目指したのは、当時モーガン研のスターティヴァントがショウジョウバエの４つの染色体を識別し、それぞれにおける遺伝子の場所を記した染色体地図を発表していたので、彼女が研究材料としていたトウモロコシでも染色体地図を作成するということでした。彼女はまず染色体を識別する上で助けになる酢酸カーミン染色法を開発しました。これは図１のカルミン酸を酢酸に溶かして鉄イオンなどを加えた染色液を用いる方法で、現在でも使われています。カルミン酸はある種のカイガラムシが合成する色素で、１９９１年まで人工合成はできませんでした。

彼女はまず自ら開発した染色法を駆使して、トウモロコシの染色体が１０組２０本であることを確定し、各染色体に１～１０番の番号を付けました（１）。この論文を発表した年（１９２９）に、ハリエット・クレイトン(図２）という大学院生がやってきて、マクリントックの指導で研究をはじめました。彼女たちが興味を寄せたのは奇妙な形の染色体を持つトウモロコシの変異体でした。当時としては、組み換えという現象があることはわかっていましたが、これが線路のポイント切り替えのようなダイナミックな染色体の物理的切断と結合の結果なのか、それとも遺伝子ごとの交換のようなミクロな現象なのかよくわかっていませんでした。

クレイトンとマクリントックは、染色体の両端にそれぞれ特徴的な構造、すなわちノブとしっぽ（非染色体ＤＮＡ）を持つ変異体をみつけて、ノブとしっぽが組み換えによっていれかわることを示しました。これによって組み換えが可視化され、誰もが染色体の切断と再結合（交叉）によって組み換えが行われることを納得しました（２）。

図２をみると、ＣとＷという２つの遺伝子の間で組み換えがおこると、本来ならＣはノブとしっぽを伴ってＦ２に出現すべきところ、Ｃはノブ、Ｗはしっぽという組み合わせでＦ２に出現することになり、物理的な染色体の切断・結合と、形質から判断される遺伝子の組み換えが同時に起こっていることがわかります。

私はこの文章を書くに当たって、マクリントックが後にトランスポゾンの理論をうちたてるきっかけとなった論文のことを調べるために文献（３）にあたりました。その中には 「１９３１年の秋、彼女はカリフォルニア大学バークレイ校の研究者から送られてきた別刷りを受け取った。そこに彼女がミズーリで見たものと同じ種類の斑入りが載っていた。バークレイの研究者たちもまた、染色体の切断あるいは欠落で生じた小さな染色体について触れていた」 という記述があります。ところがこのバークレイの研究者が誰なのかは書かれていません。

不満を感じながら調べたところ、マクリントックの論文（４）に引用文献がありました。この論文には引用文献が２つしかなく、そのひとつでした。Nawashin M. という人物の論文なのですが、さらに調べると、どうもこの引用文献のスペルが間違っているらしくて、Navashin M. という人物なら当時バークレイ校で植物の遺伝学をやっていたようなのですが、Nawashin M. という人物は見当たりませんでした。これからは全く私の想像ですが、Navasin さんはドイツ語でも論文を書いているのでドイツ人で、本来は Nawashin だったわけですが、米国では名前の発音が違って呼ばれるのが嫌で Navashin にスペルを代えたのではないでしょうか？マクリントックへの手紙には Nawashin と書いたのかもしれません。

マクリントックは斑入りの原因が、環状染色体（５、図３）内における染色分体間での姉妹鎖交換によって、セントロメアを２個含む染色体と全く含まない染色体が形成され、セントロメアを含まない染色体は細胞分裂によって娘細胞に分配されないため、色に関する遺伝子が無効になった細胞集団ができることによって斑入りが発生することを示しました（４）。

マクリントックは米国学術研究会議から奨学金をもらって、コーネル大学、ミシガン大学、カルテックなどを渡り歩いて研究をしていましたが、その奨学金が切れてしまって、ドイツで研究を続けることにしました（６）。１９３３年～１９３４年はドイツで核小体と染色体の関係について研究していましたが、ナチスドイツの台頭もあって、コーネル大学に戻ることになりました。そして１９３６年に、３０才代半ばでようやくミズーリ大学での定職（assistant professor）を得ることができました。Assistant professor といえば日本では助教のようなポストでしたが、その状態で彼女は米国遺伝学会の会長になりました。マクリントックは全く協調性がなく、喧嘩っ早い人間だったので、業績は大いに評価されてもポストは与えられず、女性の地位が低かった時代とは言え、あとからきた女性に先に准教授（associate professor）のポストが与えられるという有様でした（３）。

マクリントックが幸運だったのは、このような状況の中で旧友のマーカス・ローズがコールド・スプリング・ハーバー研究所に誘ってくれたことでした。ここは生物学のジャンルでは最も有名なシンポジウムが開催される場所として業界で知らない人はいません。夏期休暇を利用して多くの研究者が集まる施設ですが、冬は静かな環境で思う存分研究ができる場所でした（図４）。

この研究所のたたずまいはちょっと変わっていて、図４のように普通のビルディングではなく、敷地に散在する個人の住宅のような建物がひとつの研究室になっています。右はマクリントックの研究室で、彼女が亡くなったあともそのまま保存されていました。

このような施設をみると、日本人（＝日本政府）は科学を利用しようとするだけで、愛してはいないということを痛感させられます。ちなみに２００９年にはコールド・スプリング・ハーバー・アジアが中国の蘇州に開設され、活動を開始しました。これからの科学は中国によって牽引されることが予感させられます。

これからの話を理解するためにアントシアニジンという色素について説明しなければなりません。この色素は多くの植物で花や実の色に関与しており、複雑な過程を経て合成され、しかも図５のように側鎖の種類によって様々な発色が可能です。実際にはこの色素に糖が結合した配糖体の形で花や実に存在しています。

マクリントックは１９４１年１２月から、ほとんどの残りの人生をコールド・スプリング・ハーバーで過ごしました。１９４１年１２月といえば、８日の真珠湾攻撃から太平洋戦争が勃発した時期でした。彼女が「動く遺伝子」の研究を始めたのは１９４４年ですから、日本軍が太平洋の島々で玉砕を重ねていた時期です。「動く遺伝子」に関する仕事は非常に困難だったので、数年間は論文が書けませんでしたが、戦争中にもかかわらずカーネギー財団はずっとこの仕事に援助を続けました。

この間にマクリントックは、Ａｃ と Ｄｓ というＤＮＡ上の因子が、ＤＮＡ上で他の部位にジャンプして遺伝子発現の調節を行っていることをつきとめ、例えば図６で言えば、通常は紫色の実が、Ｄｓがアントシアニジン合成遺伝子の位置に移動してくると、その合成遺伝子の発現が抑制されて実の色が白くなり、Ｄｓがそこから抜けて移動すると、ふたたび色素が合成されるようになります。どの程度元に戻れるかによって発色の状況が違っていきます。これが斑入りの原因になります。

マクリントックは１９５１年にコールド・スプリング・ハーバー研究所のシンポジウムで「動く遺伝子」に関する永年の研究成果を発表しました。しかし予想に反して全く反響はなく、誰も彼女が何を言っているのか理解できませんでした。ジャコブとモノーのオペロン仮説よりも前、ワトソンとクリックの二重らせんよりも前だったので、当時としては想像もできないようなお話だったようです。ＤＮＡの一部が遺伝子の活動を制御するなどと言う概念すらなかった時代だったということもありますが、当時は遺伝学者の興味がファージや大腸菌に大きく傾いていた時代だったので、トウモロコシの話題などみんなあまり興味がなかったということもあるのでしょう。

その後も分子生物学的な裏付けがなかったので、「動く遺伝子（トランスポゾン）」はなかなか業界で認められませんでしたが、１９８２年にスプラドリングとルビン（図７）がショウジョウバエにＰエレメントが存在することを証明し（８、９）、ついに１９８３年にフェドロフ（図７）がトウモロコシのＡｃとＤｓの分子的実体とその動きを解明した（１０）ことで、間髪を入れずマクリントックはノーベル生理学医学賞を授けられることになりました。

授賞時マクリントックは８０才を越えていましたが、メンデルと違って生きているうちにきちんと再評価されたのはよかったと思います。ただ私の意見としては、ニーナ・フェドロフと共に授賞すべきだったのではないか、そのほうがマクリントックも嬉しかったのではないかと思いますね。天才だけでなく、実験的証明を行った人々についても、きちんと評価されて然るべきです。




現在ではトランスポゾンは細菌からヒトに至るまでユニバーサルに存在することが知られていますし、種類も様々です。少し長くなりそうなので、続きは次回に述べることにします。


参照

１） B. McClintock.,  Chromosome Morphology in Zea mays. Science 69: 629　(1929)
http://science.sciencemag.org/content/69/1798/629.long

２）Creighton, H., and McClintock, B. 1931 A correlation of cytological　and genetical crossing-over in Zea mays. PNAS vol. 17: pp. 492–497 (1931)
http://www.esp.org/foundations/genetics/classical/holdings/m/hc-bm-31.pdf

３）Ray Spangenberg  and  Diane Kit Moser  著,  大坪 久子 (翻訳) 　「ノーベル賞学者バーバラ・マクリントックの生涯　動く遺伝子の発見」　 養賢堂　２０１６年刊

４）B. McClintock., A correlation of ring-shaped chromosomes with variegation in zea mays., Natl. Acad. Sci. USA, vol.18, no.12, pp. 677-681 (1932)
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1076312/pdf/pnas01740-0003.pdf

５）Lillian V. Morgan., Correlation between shape and behavior of archromosome., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 12., pp.180-181 (1926)
http://www.pnas.org/content/12/3/180

６）Famous scientists. Barbara McClintock.,
https://www.famousscientists.org/barbara-mcclintock/

７）Barbara McClintock, The origin and behavior of mutable loci in maize., Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol. 36,  pp. 344-355 (1950)

８）Spradling AC, Rubin GM,  "Transposition of cloned P elements into Drosophila germ line chromosomes". Science. vol. 218 (4570): pp. 341–347. (1982)
Bibcode:1982Sci...218..341S. PMID 6289435. doi:10.1126/science.6289435.

９）Rubin GM, Spradling AC, "Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors". Science. vol. 218 (4570): pp. 348–353. (1982)
Bibcode:1982Sci...218..348R. PMID 6289436. doi:10.1126/science.6289436.

１０）N. Fedoroff, S. Wessler, and M. Shure, Isolation of the transposable maize controlling elements Ac and Ds., Cell vol. 35, pp. 235-242 (1983)
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/6313225

生物学茶話＠渋めのダージリンはいかが８６： ＰＣＲ

ＰＣＲとはポリメラーゼ・チェイン・リアクションの略称で、「科捜研の女」などでもお馴染みですが、痕跡的なＤＮＡを大量に増やす方法です。本題に入る前に、少し歴史的経緯をみてみましょう。

ところで一般には大腸菌くらい簡単に培養できるのだろうと思われがちですが、昭和時代にはそういうわけにはいきませんでした。私が学生時代、同じ建物に微生物学教室がありましたが、そこには宇宙船のハッチのようなものがあって、中に入ると数人が作業できるような部屋があり、各種実験器具、培地、シャーレ、Ｌブロス、ピペットなどが大量に積み重ねられていました。これは高温高圧で滅菌作業をするボイラー室でした。

空気中には雑菌が浮遊しているので、これらを芽胞を含めて完全に死滅させるには高温高圧（たとえば１２１℃、２０分）で処理しなければいけません。そのためにはボイラー室を用意して、資格を持った技術員を雇用しなければなりません（１）。実験は普通の実験台ではできず、クリーンベンチという、外から雑菌が流入しないよう空気の流れをコントロールした、巨大な無菌ボックスの中に手を突っ込んで行わなければなりません。現在では実験器具はすでに企業で滅菌した使い捨て製品を買って使う場合が多く、このてのプラスチック製品は使った後棄てるだけなので、よほど特殊な実験でなければボイラー室を使うことはなく、廊下の隅にでも置けるようなオートクレーヴ装置（高圧蒸気滅菌）で事足ります（２）。ただしクリーンベンチで仕事をしなければいけないことに変わりはありません。

ですから当時の生命科学研究者にとって、大腸菌にプラスミドを入れて遺伝子を増幅させるという作業は、大がかりな設備が整った微生物学の研究室以外ではじめるには大きな壁がありました。増幅させたいのはＤＮＡという化学物質なので、なんとか細菌を使わず酵素を使ってやりたいと思うのは当然です。そこに登場したのがマリス（図１、Kary Banks Mullis）でした。

マリスはカリフォルニア大学バークレイ校で学位を取った後、カンザス大学の小児心臓病研究室のポストドクになり（１９７２年）、１９７５年までに２度離婚して仕事も辞めバークレーに舞い戻りました。バークレーでは最初の妻が経営するコーヒーショップで店長をやっていたそうです（３）。そんなある日、バークレー校時代の友人であるトーマス・ホワイト（図１）と再会し、ホワイトの紹介でカリフォルニア大学サンフランシスコ校のポストドクになり、脳研究をはじめました。しかしそこも結局すぐにやめてしまい、困ったホワイトは自分が幹部社員であるシ－タス社に、技術員としてもぐりこませることにしました（３、４）。持つべきものは友です。

マリスは著しく協調性を欠く性格で、会社でまわりと衝突をくりかえすやっかいものでしたが、ホワイトはあえてＤＮＡ合成室長に抜擢しました。ここでマリスはＤＮＡ合成自動化装置の製品化で貢献して、ようやく会社での自分の立場を確立しました。そうして１９８３年、有名な出来事が起こります。文献４の記述を引用します。

In 1983, while driving along the Pacific Coast Highway 128 of California in his Honda Civic from San Francisco to his home in La Jolla, California, USA, Kary Mullis was thinking about a simple method of determining a specific nucleotide from along a stretch of DNA. He then, like many great scientists, claimed having a sudden flash of inspirational vision. He had conceived a way to start and stop DNA polymerase action and repeating numerously, a way of exponentially amplifying a DNA sequence in a test tube（４）.

ドライブ中に突然あるアイデアが浮かんだというわけです。それはＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェイン・リアクション）法の根幹となるすばらしいアイデアだったのですが、マリスは相変わらず喧嘩をくりかえし、アイデアが採用されるどころか「早くクビにしろ」という多くの研究員からの要請がホワイトのもとに届く有様でした。

ホワイトはそのアイデアを評価しましたが、実験が下手くそな上に室員との折り合いも最悪なマリスにまかせておいてはどうにもならないと考え、マリスを棚上げして、彼のアイデアを実現するプロジェクトを別の研究室で立ち上げました。そうしてからはランディ・サイキとスティーヴン・シャーフという優秀な研究者達が中心となって、順調に仕事は完成しました。

論文のファースト・オーサーはマリスで、マリスがまとめる予定だったのですが、さっぱり論文を書かないので、結局１９８５年にサイキ（５）、１９８６年にシャーフ（６）が論文を書くことになりました。マリスがやっとこさ論文を書いたのはオリジナルペーパーというより実験技術の本で、１９８７年になってしましました（７）。そこまで待っていたらシータス社は特許をとれなかったでしょう。それでもマリスは１９９３年にノーベル化学賞を単独で受賞しました。

ここでＰＣＲ法の基盤となるＤＮＡの性質を簡単に述べます。ＤＮＡの二重鎖は高温（図２では９４℃）で解離し一重鎖となります。ゆっくり低温にもどすとアニーリングがおこって、再び二重鎖が形成されますが、急速に温度を下げると長いＤＮＡ鎖はアニーリングをおこしにくく、一重鎖のままとなります。ここに短いプライマーを投入すると相方の相補鎖より優先的にＤＮＡ鎖に結合することができます。

そこで５０℃～６０℃に急冷した後、プライマーを大過剰に投入してＤＮＡと結合させます（図３）。

次に７２℃に温度を上げて高分子ＤＮＡのアニーリングを阻止しながら、ＤＮＡポリメラーゼと基質を投入してＤＮＡ合成を行わせます（図４）。この温度でＤＮＡ合成を行わせるには、後述のＴａｑポリメラーゼという特殊な耐熱性のＤＮＡポリメラーゼが必要です。

もともと生物が出現しはじめた頃の地球は高温で、当然その頃の細菌・古細菌は好熱性だったわけです（８）。そして現在でも一部の真正細菌や多くの古細菌は温泉などの高温環境で生活しています。しかしはるか昔の地質時代とはことなり、現在は芽胞という熱に強い特殊な仮死状態で生きている生物も多く、そのような生物では酵素がすべて耐熱性とは限りません。トーマス・ブロックとハドソン・フリーズ（図５）はそんななかから、Thermus aquaticus　という至適増殖温度が７０℃～７２℃の真正細菌を分離しました（９）。これは当時としては驚異的な高温で生育する生物でした。しかもこの温度はＰＣＲ法を実行する上で都合の良い温度でした。

アリス・チエン（図５、現アリス・チエン・チャン）は Thermus aquaticus からＤＮＡポリメラーゼを抽出・精製し、これは後に学名の頭文字から Taqポリメラーゼと名付けられました（１０）。ブロック、フリーズ、チエンらはこんな面白いめずらしいものがあるよというような感覚で研究していたと思いますが、これが２０世紀でも指折りのイノベーションになるとは、全く予想していなかったでしょう。科学の進展は思わぬところからやってくるというのは、このブログでも繰り返し述べているところです。

通常のＤＮＡポリメラーゼを使ってＰＣＲ法をやろうとすると、３７℃でＤＮＡ合成を行わなければならず、この間にもとの巨大分子であるＤＮＡのアニーリングがおこるために効率が下がり、さらにまずいことに９４℃に温度をあげるとＤＮＡポリメラーゼは失活します。そうすると１サイクルごとに酵素を新たに添加することが必要で、かつだんだん効率が悪くなるわけです。こんなところが誰もＰＣＲなどということを考えなかった理由なのでしょう。

しかしＴａｑポリメラーゼを使うと状況は一変します。７２℃で絶好調、９４℃でも失活しないので酵素の添加は不要ですし、７２℃の反応では長鎖ＤＮＡのアニーリングはおこらないので、効率も落ちません。つまり温度をたとえば　９６℃→５６℃→７２℃→９６℃→５６℃→７２℃→　というように繰り返し変化させるだけで、魔法のようにＤＮＡが増幅されていきます（１１）。このようなことを考えると、Ｔａｑポリメラーゼの発見を差し置いて、マリスが単独でノーベル賞を受賞したことには疑問が感じられます。

図６をみていただくと２サイクル目で、目的のＤＮＡが１本鎖だけですが（緑）生成されていることがわかります。図７の３サイクル目では８本生成される二重鎖ＤＮＡのうち、２本が目的ＤＮＡの二重鎖です（緑ｘ２）。いったん二重鎖目的ＤＮＡが生成されると次のサイクルではその二重鎖ＤＮＡが複製されます。こうして４サイクル目には１６本生成される二重鎖ＤＮＡのうち８本が目的の二重鎖ＤＮＡとなり、サイクルが進むにつれて目的ＤＮＡの純度は上がって、最終的にはそれ以外のＤＮＡは無視できるくらいの％になります。

図６、図７をじっくりとよく眺めてください。最初は様々なＤＮＡが合成されますが、同じことを繰り返しているうちに目的のＤＮＡが自動的にメインになっていく。そう、まるで魔法のようなギミックに茫然とします。

先輩からはこのＰＣＲの作業をやるために、何時間トイレを我慢したというような話を聞かされました。３つのウォーターバスを用意して、それぞれ９６℃、５６℃、７２℃に設定し、やることと言えば、時間が来ると試験管をあっちからこっちのバス移動させるだけの作業を延々と繰り返すだけなのです。お疲れ様。

しかし当然２～３年もすれば自動的に移動させる装置が発売され（図８Ａ）、さらに同じ試験管の液体を極めて短い時間で温度変化させる新機軸の開発もあって、やがて水槽は不要となり、極めて小型の装置で作業を行えるようになりました（図８Ｂ）。現在では生成したＤＮＡをモニターできるような光学系を装備したリアルタイムＰＣＲ装置が主流となっています（図８Ｃ）。

ＰＣＲが普及することによって、バイオテクノロジーの研究室や工場のみならず、科学捜査や感染微生物の同定など社会の様々な場面で、この技術が利用されるようになりました。本物のジュラシック・パークも開園できるかもしれません。

ひとつ気をつけなければならないのは、もとのサンプルに微量のＤＮＡが混在していた場合、それも増幅されてしまうということです。生成物を電気泳動法などで解析すれば、何種類のＤＮＡが生成されたかわかります。エラーで実験失敗程度なら笑えますが、科学捜査の失敗や、思わぬ病原遺伝子の増幅などということがおこればしゃれになりません。

参照

１）https://www.sat-co.info/boiler-engineer

２）http://www.zetadental.jp/category-1888-b0-%E3%82%AA%E3%83%BC%E3%83%88%E3%82%AF%E3%83%AC%E3%83%BC%E3%83%96.html?_ad=1&gclid=EAIaIQobChMIx5K-37OK1gIVywcqCh11wg9bEAAYASAAEgKsi_D_BwE

３）野島博著　「分子生物学の軌跡」　化学同人　（２００７）

４）Ma Hongbao, Development Application of Polymerase Chain Reaction (PCR), The Journal of American Science vol. 1, no. 3, pp.1-47 (2005)

５）Randall K. Saiki, Stephen Scharf, Fred Faloona, Kary B. Mullis, Glenn T. Horn, Henry A. Erlich, Norman Arnheim. "Enzymatic Amplification of β-globin Genomic Sequences and Restriction Site Analysis for Diagnosis of Sickle Cell Anemia" Science vol. 230 pp. 1350-1354 (1985).
http://www.sciencemag.org/site/feature/data/genomes/230-4732-1350.pdf

６）SJ Scharf, GT Horn, HA Erlich　"Direct Cloning and Sequence Analysis of Enzymatically Amplified Genomic Sequences" Science vol. 233, pp.1076-1078 (1986).

７）Mullis KB and Faloona FA  "Specific Synthesis of DNA in vitro via a Polymerase-Catalyzed Chain Reaction."  Methods in Enzymology vol. 155(F) pp. 335-350 (1987).

８）https://morph.way-nifty.com/lecture/2016/09/post-1be1.html

９）Brock, Thomas D.; Hudson Freeze (August 1969). "Thermus aquaticus gen. n. and sp. n., a nonsporulating extreme thermophile". Journal of Bacteriology. American Society for Microbiology. 98 (1): 289–297. PMC 249935 Freely accessible. PMID 5781580.

１０）A Chien, D B Edgar, and J M Trela., Deoxyribonucleic acid polymerase from the extreme thermophile Thermus aquaticus. J Bacteriol. 1976 Sep; 127(3): 1550–1557.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC232952/

１１）RK Saiki, DH Gelfand, S Stoffel, SJ Scharf, R Higuchi, GT Horn, KB Mullis, HA Erlich.,  Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase.,  Science  29 Jan 1988: Vol. 239, Issue 4839, pp. 487-491DOI: 10.1126/science.2448875

生物学茶話＠渋めのダージリンはいかが８５： ベクター

ベクターというのはラテン語で運搬者という意味だそうです。分子生物学では主に遺伝子の運搬者という意味で使います。

これまでの話で明らかなように、制限酵素で切断したＤＮＡは断点の周辺に相補的な構造ができるので、別々のソースから得た２本鎖ＤＮＡを同じ制限酵素で切った場合に、別々のＤＮＡであっても自在に接続できることがわかりました。ここですぐに思いつくのは遺伝子を細胞に導入したいということです。それによって人工的な「進化」が可能になります。ところがＤＮＡは簡単には細胞に入り込めません。これは当たり前で、ＤＮＡがどんどん細胞に入ってくればさまざまなタンパク質が野放図に合成される可能性があり、代謝のバランスが崩壊して生命を維持することができなくなると思われますし、例え崩壊しなくても種という概念が成立せず、生物のあり方が地球上の生物とは全く異なることになるからです。

ひとつの遺伝子を細胞に導入するということは、未知遺伝子の機能をさぐるのはもちろん、「ある遺伝子を欠損した細胞に、もとのあるべき遺伝子を導入すると失われた機能が回復する」ということがわかれば、その遺伝子の機能を確認できるという目的も果たせますし、生物に新しい機能を付加するとか、細菌に有用なタンパク質を合成させるとか、遺伝子治療を行なうとかの野心的な目標も当然めざしたいわけです。

そこでスタンレー・コーエン、ポール・バーグ、ハーバート・ボイヤーらが目を付けたのがプラスミドというＤＮＡです（図１）。これは生物が本来持っているゲノム以外に、独立に増殖する機能を持って住み着いているＤＮＡで、原核生物には一般的に存在するものですが、酵母にも存在することが知られています。プラスミドは宿を借りているといっても、寄生虫のようなわるさはしませんし、むしろホストにとって有用な役割を果たしています。ですからホストによってそのＤＮＡはメチル化されて保護されており、ファージのように分解されることがありません。この意味では真核生物における共生に近い関係だと思われます。

例えばコリシンというプラスミドはホストには無害で他の細菌を殺す物質の遺伝子ですし、Ｒ因子プラスミドは薬剤抵抗性をホストに付与します。Ｆ因子プラスミドは線毛を作り出す遺伝子を持っており、線毛でＦ因子をもたない細菌をひきよせて接合状態をつくり、複製したＦ因子や他のプラスミドを送り込むことができます（図１）。接合は線毛が作られなくてもおこり、Ｒ因子なども複数の方法で他の細胞に送り込むことができます。Ｆ因子が細菌本体のゲノムに組み込まれるとゲノム自体が他の細胞に送り込まれることもあるので、これが細菌の有性生殖だとも言えますが、これは性をどのように定義するかによって考え方が変わります（１）。

ベクターに送り込みたい遺伝子を含むＤＮＡを、その遺伝子の両側で制限酵素 EcoRI を使って切断すると、図２のように ＡＡＴＴ－－－ＴＴＡＡ フラグメントができます。同じ酵素でベクターとして用いるプラスミドを切断して－－－ＴＴＡＡ　　ＡＡＴＴ－－－という断端を作成すれば、そこにアニーリングによってフラグメントを挿入することができます。

アニーリングというのは、もともと二重鎖を構成していたＤＮＡが１００°Ｃで変性して一重鎖になったとしても、６０°Ｃくらいの温度を保つことによって、相補的な配列が水素結合をつくってもとの二重鎖にもどるという現象です。相補的付着末端一本鎖を持つ二本鎖ＤＮＡ同士も、条件を最適化すれば同じメカニズムで付着末端同士で結合して、結果的に環状ＤＮＡをつくり、最後にＤＮＡリガーゼで３’ＯＨと５’Ｐをつないであげると、切れ目のない新しい環状二重鎖ＤＮＡを形成することができます（図２）。

この方法で、遺伝子をプラスミドに組み込むことができます。プラスミドは独自に複製を行うための複製開始点領域を持っていますが、それ以外に抗生物質耐性のゲノムを持たせておきます。こうするとプラスミドを増やしたときにその抗生物質の存在下で細菌を培養すると、抗生物質耐性の遺伝子を持つプラスミドを取り込んだ細菌だけが抗生物質の影響を受けずに増殖するので、プラスミドを取り込んだ細菌を見つけやすくなります。図２ではテトラサイクリン耐性のプラスミドが用いられています。

初期の組み換え実験に頻繁に用いられたベクターは、図３のようなものです。ｐＢＲ３２２と名付けられましたが、ｐはプラスミド、ＢＲは写真のボイヤーの研究室で働いていたポストドクの　Bolivar　と　Rodriguez　の頭文字をとったものです。さまざまな制限酵素でそれぞれ１ヶ所で切断されるように設計されています。抗生物質耐性領域に断点があると、そこが切断された場合耐性が失われるので、２ヶ所に抗生物質耐性領域があります。図３の場合アンピシリン（amp）とテトラサイクリン（tet）に耐性の領域左右にがあります。Eco RI または Nde I を用いた場合には、断点がこれらの領域の外なので、両方の抗生物質耐性領域が生きていることになります。

遺伝子操作においては、しばしばＤＮＡリガーゼという言葉が登場します。この酵素についてはこのブログでも何度か取り上げていますが（４、５）、基本的に図４Ａの様に付着末端どうしがくっついた状態で、最終的に３’ＯＨと５’Ｐを結合させて断点のないＤＮＡを完成させる役割をもっています。図４Ｂのような平滑末端同士を結合させるのは苦手です。ところがヴィットリオ・スガラメッラ（６、図４）らは、Ｔ４ファージのＤＮＡリガーゼはある条件で平滑末端を結合させることを発見したのです（７、図４Ｂ）。

細胞内では、しばしばＤＮＡの損傷や修復、ウィルスによるＤＮＡ合成などに伴って、不要なＤＮＡ断片が発生します。これらはすみやかにＤＮＡ分解酵素で分解してしまわなければいけません。このような浮遊するジャンクＤＮＡを、非特異的に結合して巨大ＤＮＡにしてしまうような酵素はあってはならないものです。実際に細菌や真核生物はこのような酵素を保持しませんが、ファージの中になぜかこのような酵素を持つ者がいたわけです。平滑末端同士を結合できる酵素がみつかったことは、遺伝子組み換えの作業には福音でした。

例えば図５のように Eco RI による切断部位を１ヶ所持つ短い鎖長のリンカーＤＮＡ（青灰色）を作成しておき、この断片を研究したいＤＮＡ（黄緑色）の両端にＴ４リガーゼで接続して、その後 Eco RI で切断し、同様に Eco RI で切断したベクターとくっつけると組み換えＤＮＡが完成します（図５）。こうして作成された環状組み換えＤＮＡは、基本的にプラスミドと同じなので、大腸菌に挿入して大腸菌を培養すると、自然にベクターも倍々ゲームで増殖し、したがって目的のＤＮＡを爆発的に増やすことができます。

もうひとつ、奇妙な酵素について言及しなければなりません。それはターミナルヌクレオチジルトランスフェラーゼ（terminal deoxynucleotidyl transferase）という酵素で、名前が長いのでよく ＴｄＴ という略称が使われます。この酵素は鋳型（テンプレート）非依存的にＤＮＡを３’ＯＨから延長するというユニークな機能を持っています。図６に示したように、１本鎖または２本鎖でも３’ＯＨが突出したＤＮＡを延長するのが得意ですが（活性大　図６）、平滑末端を持つ２本鎖の末端３’ＯＨからの延長も可能です（活性中）。５’Ｐが突出した２本鎖ＤＮＡの３’ＯＨから延長するのは得意ではありませんが、不可能ではないようです（活性小）。

この酵素はＡＧＣＴをランダムに付加していくので、ＤＮＡを合成することはできても複製することはできません。しかし実験室では基質としてｄＡＴＰだけを与えることもできるので、こうするとＴｄＴはＡＡＡＡＡｎのように、ＤＮＡの末端にホモポリマーを付加していくような形での反応を行わせることができます（図６）。そもそもなぜこんな奇妙な酵素が存在するのかということですが、哺乳類では抗体やＴ細胞抗原受容体の多様性を確保するために重要な役割を果たしているようです（８）。本来役に立たないはずの、障害を持った酵素が思わぬ用途で使われる・・・・・まさしく進化は「ケガの功名」を積み上げたものであることを教えてくれる酵素です。

ポリＡとポリＴなど相補的ホモポリマーの親和性は高いので、これを利用して図７のように組み換えＤＮＡをつくることができます。両端が平滑のＤＮＡにまずポリＡを結合させ、ベクターにはポリＴを結合させてアニールすると、組み換えＤＮＡが作成できます。ただＡおよびＴの数は同じにできないので、あとで調整が必要になります。予め塩基数が決まったホモポリマーを用意して、Ｔ４リガーゼで結合しても同様な実験ができます。制限酵素による切断部位からポリＡとポリＴを延ばすようにすれば、あとで制限酵素によって目的部位を切り出すこともできます。

ここまで述べてきた組み換えＤＮＡ作成技術の前提となる大腸菌にファージやプラスミドを導入する技術は、１９７０年にハワイ大学のモートン・マンデルと比嘉昭子によって開発されました。彼らは制限能（免疫能）のない大腸菌を、低温下で塩化カルシウム処理すると、外界のＤＮＡ断片を菌体内に取り込ませることができることを証明しました（９、１０、図８）。

外界ＤＮＡを取り込めるようになった細胞をコンピテントセルといいます。コンピテントセルに組み換え型プラスミドを取り込ませ培養すれば増殖させることができます。取り込まなかった細胞を排除するには、たとえばアンピシリン耐性の遺伝子を持つプラスミドを取り込ませた場合、アンピシリンを培地に入れるとプラスミドを取り込まなかった細胞は死滅するので、取り込んだ細胞を選択することができます。

モートン・マンデルと比嘉昭子の写真は、ウェブサイトを探しましたが残念ながらみつかりませんでした。彼らが先鞭を付けたトランスフェクション（遺伝子導入）の技術は現在にもひきつがれ、さらに哺乳動物細胞や個体への遺伝子導入の方法が盛んに研究されています。

プラスミドを使わずバクテリオファージやウィルスを用いた遺伝子導入の手法があります（１１）。ラムダファージが最も有名です。ラムダファージのＤＮＡはファージの殻の中では線状なのですが、両端にＣＯＳという相補的な部位があり、大腸菌に感染すると環状化します（図９）。このＤＮＡをベクター（コスミドベクター）として使いやすいように改変して使用します。

プラスミドと比べてファージ（ウィルス）ペクターの欠点は、ファージ（ウィルス）の殻の中は狭いので、長いＤＮＡを組み込むとはいりきらなくなることです。このため増殖に必要がないファージの遺伝子の一部を切り取って短いベクターをつくり、ある程度長めの遺伝子でも組み込めるようにします（図９）。ファージ（ウィルス）ベクターの利点は、トランスフェクションで苦労しなくても自動的にホストの細胞に侵入してくれることです。

哺乳動物細胞への遺伝子導入については、未知遺伝子なら導入した遺伝子を発現させて機能を研究する、遺伝子発現を制御する機構について研究する、実験動物に変異遺伝子を発現させて遺伝病を発症させる、遺伝病の動物に正常遺伝子などを移入して治療するなどの研究が行われています。

遺伝子導入の方法はいろいろあって、タカラバイオのサイトから図１０にコピペしておきます（１２）。いろいろあるといっても、それは試験管の中での実験についての話であって、患者の遺伝子治療に使えそうなのは今のところウィルスベクターを使う方法しかありません。

ウィルスの場合、ウィルスの中に目的の遺伝子を入れさえすれば感染によって自動的に細胞にはいるので、遺伝子移入は容易なのですが、問題は安全性です。ウィルスもどきが体内で増殖したり、炎症を引き起こしたり、遺伝子発現に影響を与えて病気になるのではお話になりません。実際１９９０年代にはすぐにでも臨床に使えるような雰囲気でしたが、どうなったかというと、１９９９年にペンシルベニア大学で治療中の患者で、注入したアデノウィルスベクターによって全身性の炎症反応がおきて、患者が死亡するという事故が発生し（ゲルジンジャー事件）、さらに２００２年にはフランスで２名の患者が白血病を発症するなどの問題がおきて（１３）、一気に研究は停滞しました。フランスの事故の場合、レトロウィルスベクターが癌遺伝子の上流に導入されたために、癌遺伝子が活性化して発病したようです（１４）。医師・研究者が前のめりになりすぎた結果だと思います。

とはいえ、最近再び遺伝子治療（疾病の治療を目的として遺伝子または遺伝子を導入した細胞を人の体内に投与すること）の機運が盛り上がっており、２０１８年には遺伝子治療薬がはじめて認可されるようです（１５）。まあ過大な期待はしないで見守りましょう（１６）。


参考

１）プラスミドってなに？　
http://www.seibutsushi.net/blog/2008/07/513.html

２）Bolivar F, Rodriguez RL, Betlach MC, Boyer HW (1977). "Construction and characterization of new cloning vehicles. I. Ampicillin-resistant derivatives of the plasmid pMB9". Gene. 2 (2): 75–93. PMID 344136. doi:10.1016/0378-1119(77)90074-9.

３）Bolivar F, Rodriguez RL, Greene PJ, Betlach MC, Heyneker HL, Boyer HW, Crosa JH, Falkow S (1977). "Construction and characterization of new cloning vehicles. II. A multipurpose cloning system". Gene. 2 (2): 95–113. PMID 344137. doi:10.1016/0378-1119(77)90000-2.

４）ワイス博士の不遇　
http://app.cocolog-nifty.com/t/app/weblog/post?__mode=edit_entry&id=17207703&blog_id=203765

５）岡崎フラグメント
http://app.cocolog-nifty.com/t/app/weblog/post?__mode=edit_entry&id=86368774&blog_id=203765

６）Vittorio Sgaramella
http://www.scienzainrete.it/documenti/autori/vittorio-sgaramella

７）Sgaramella V, Van de Sande JH, Khorana HG., Studies on polynucleotides, C. A novel joining reaction catalyzed by the T4-polynucleotide ligase. Proc Natl Acad Sci U S A. 1970 Nov;67(3):1468-75. (1970)
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/5274471

８）Edward A. Motea and Anthony J. Berdis, Terminal Deoxynucleotidyl Transferase: The Story of a Misguided DNA Polymerase.,  Biochim Biophys Acta. vol.1804(5):  pp. 1151–1166. (2010)  doi:  10.1016/j.bbapap.2009.06.030
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2846215/

９）Mandel, M. and Higa, A. (1970). “Calcium-dependent bacteriophage DNA infection”. Journal of Molecular Biology 53 (1): 159-162. PMID 4922220.
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0022283670900513

１０）Akiko Higa,  Morton Mandel, Factors Influencing Competence of Escherichia coli for Lambda-Phage Deoxyribonucleic Acid Infection., Japanese Journal of Microbiology, Vol. 16, No. 4,  pp. 251-257 (1972)
https://www.jstage.jst.go.jp/article/mandi1957/16/4/16_4_251/_article/-char/ja/

１１）Ｒ. Ｗ. オールド、Ｓ.Ｂ. プリムローズ著　「遺伝子操作の原理」第５版　倍風館　（２０００）

１２）タカラバイオ　遺伝子導入実験ハンドブック
http://catalog.takara-bio.co.jp/PDFS/transgenesis_experiment.pdf

１３）小澤敬也　遺伝子治療テクノロジーの開発とその応用　ウィルス　vol.54, no.1, pp. 49-57 (2004)
https://www.jstage.jst.go.jp/article/jsv/54/1/54_1_49/_pdf

１４）島田隆　日本の遺伝子治療の課題　（２０１３）
http://www.mhlw.go.jp/file.jsp?id=146735&name=2r98520000033pt6.pdf

１５）市場調査レポート　2017年版 遺伝子治療薬の将来展望　Seed Planning
http://store.seedplanning.co.jp/item/9516.html

１６）ＣＡＲ－Ｔ療法　リンパ球バンク株式会社　（２０１６）
https://www.lymphocyte-bank.co.jp/blog/medicine/%EF%BD%83%EF%BD%81%EF%BD%92%EF%BC%8D%EF%BD%94%E7%99%82%E6%B3%95/