生物学茶話＠渋めのダージリンはいかが５４： ｍＲＮＡへの道１

細菌では転写が行われると、通常できたばかりのＲＮＡにリボソームがくっついて翻訳（ＲＮＡからタンパク質へ）が開始されます。ですから鋳型ＤＮＡと転写されたＲＮＡと翻訳工場のリボソームが一体化した状況の電子顕微鏡写真が撮影されています。

しかし真核生物ではそうはいきません。転写は核内で行なわれますが、リボソームは核の外の細胞質内にあります。従ってＲＮＡを核膜を通過させて核の外に出し、そのＲＮＡをリボソームまで導かなければなりません。

このようなプロセスを裸のＲＮＡにやらせようとすると、リボソームにたどり着く前にヌクレアーゼで分解されて影も形もなくなってしまうでしょう。そこで転写されたＲＮＡには直ちに５’側にはキャップ、３’側にはポリＡテイルが付加されて、端からＲＮＡ分解酵素にかじられるのを防いだり、自らがｍＲＮＡであることのシグナルとして機能させたりという役割を与えられています（図１）。

キャップとテイルは翻訳領域に直接つけられるのではなく、それぞれ翻訳されない領域 （5'-UTR=5' untranslated region, and 3'-UTR=3' untranslated region) で隔てられた部分につけられます。つまりｍＲＮＡはその全域がタンパク質の情報として翻訳されるのではなく、翻訳領域の両側（上流・下流）に余裕を持って非翻訳領域を配置し、さらにその両端にキャップとテイルを配置するような構造になっています（図１）。

キャップの存在を発見したのは古市泰宏 で、当時の事情は彼自身が詳しいレビューを出版していますし（１）、日本語での自慢話も読めます（２）。

図２に示したように、転写されたＲＮＡの５’末端ではリボース２つの２’の位置がメチル化されていて、さらに末端に７－メチルグアノシン３リン酸が５’－５’という奇妙な配位で結合しています。通常ヌクレオチドは５’－３’結合しかしないので、生化学的にこれは特殊な例と言えます。この構造のために通常のエクソヌクレアーゼはアクセスできなくなっています。

ポリＡポリメラーゼはすでに１９６０年にエドモンズらによって発見されていましたが（図３、参照３）、ながらく何のためにあるのかわかりませんでした。転写されたＲＮＡのテイルにポリＡを付加するためだとわかったのは１０年以上後になります（４，５）。転写されたＲＮＡにキャップがかぶせられるのは数秒以内。テイルが付加されるのは３０秒以内だとされています（６）。

ポリＡテイルがどのような役割を担っているかは現在でもホットな研究課題です。ポリＡテイルに親和性をもつタンパク質は数多く、例えばＰＡＢＰ１というタンパク質ひとつとってみても、翻訳の開始、翻訳の促進、翻訳の抑制、ｍＲＮＡの安定化、ｍＲＮＡのターンオーバーなど驚くほど多彩なプロセスに関わっているようです（７）。

キャップとテイルでｍＲＮＡの加工は終わりかと思われていたのですが、１９７７年になって予想外の事態になりました。当時ＤＮＡとＤＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡを試験管の中で対面させて、相補的な塩基配列を持つ部分を結合させる（ハイブリダイゼーション）という技術が開発され、また電子顕微鏡で核酸分子を検鏡する技術も開発されました。

そこでアデノウィルスの完成された殻タンパク質をコードするｍＲＮＡと遺伝子ＤＮＡをハイブリダイズさせてみると、ぴったりとは符合せず、ＤＮＡが余ってループをつくる部分ができることがわかりました（８）。これは転写されたＲＮＡの一部が切り離されたために、ＤＮＡの一部がハイブリッドを形成できなかったことを示唆します。

このような実験結果は、図４のような模式図によって説明できます。切り離される部分をイントロンといいます。イントロンの塩基配列は当然タンパク質の構造には反映されず、ｍＲＮＡは残されたエクソンとキャップとポリＡテイルによって構成されます（図４）。イントロンが切り離され、エクソンが結合されるプロセスをスプライシングとよびます。イントロンが切り離される前のＲＮＡをプレｍＲＮＡとよびます。核に存在するｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ以外のＲＮＡをまとめてｈｎＲＮＡ（heterogenous nuclear RNA) とよぶこともあります。hnRNA がプレｍＲＮＡを意味する場合もあります。

レダーらのグループはより明確にスプライシングの存在を証明しました。彼らはマウスのβグロビン遺伝子の塩基配列を完全解明し、どこからどこまでがエクソン、どこからどこまでがイントロンなどの詳しい研究結果を示しました（図５、参照９）。これによって遺伝子が内部のふたつのイントロンによって分断されていることがわかりました。福岡大学のサイトにβグロビン遺伝子の全塩基配列やエクソン・イントロンの位置などが示されています（１０）。

細菌や古細菌にも遺伝子の分断はみられますが、一般的ではありません。真核生物でも酵母やカビにはごく少数しかみられませんが、ヒトやマウスでは遺伝子ひとつあたり平均７～８ヶ所の分断がみられます（１１）。

参照：

１） Yasuhiro Furuichi,  discovery of m7G-cap in eukaryotic mRNAs. Proceedings of the Japan Academy, Series B
Vol. 91 (2015)  No. 8  p. 394-409
https://www.jstage.jst.go.jp/article/pjab/91/8/91_PJA9108B-01/_article

２）古市泰宏、  走馬灯の逆廻し：RNA研究、発見エピソードの数々｜はじめに キャップ構造の発見
https://www.rnaj.org/component/k2/item/383-furuichi-1

３）Edmonds M, Abrams R., Polynucleotide biosynthesis: Formation of a sequence of adenylate units from adenosine triphosphate by an enzyme from thymus nuclei. J Biol Chem 235: 1142–1149.　(1960)

４）Edmonds M, Vaughan MR, Nakazato H. 1971. Polyadenylic acid sequences　in the heterogeneous nuclear RNA and rapidly-labeled polyribosomal RNA of HeLa cells: Possible evidence for a precursor relationship. Proc Natl Acad Sci 68: 1336–1340. (1971)

５）Darnell JE, Philipson L, Wall R, Adesnik M. Polyadenylic acid sequences: Role in conversion of nuclear RNA into messenger RNA. Science 174: 507–510.　(1971)

６）JE. Darnell, Jr., Reflections on the history of pre-mRNA processing and highlights of current knowledge: A unified picture. RNA vol.19, pp. 443-460 (2013)
http://rnajournal.cshlp.org/content/19/4/443.full

７）Richard W.P. Smith, Tajekesa K.P. Blee and Nicola K. Gray, Poly(A)-binding proteins are required for diversebiological processes in metazoans. Biochem. Soc. Trans. vol. 42, pp. 1229–1237 (2014) doi:10.1042/BST20140111

８）Berget S.M., Moore C., Sharp P.A., Spliced segments at the 5' terminus of adenovirus 2 late mRNA. Proc. Nati. Acad. Sci. USA, Vol. 74, pp. 3171-3175, (1977)

９）Konkel DA, Tilghman SM, Leder P. The sequence of the chromosomal mouse β-globin major gene: Homologies in capping, splicing and poly(A) sites. Cell vol.15, pp.1125–1132. (1978)
http://www.cell.com/cell/fulltext/0092-8674(78)90040-5

１０）http://www.sc.fukuoka-u.ac.jp/~bc1/Biochem/transcrp.htm

１１）J.D. Watson et al. Molecular Biology of the Gene 6th edn p.416 (2008)

生物学茶話＠渋めのダージリンはいかが５３： 転写２

し転写１では細菌の転写について述べましたが、転写２では真核生物について述べます。細菌でも真核生物でもＤＮＡの情報をＲＮＡにコピーして、それを設計図としてリボソームでタンパク質を合成するという方式にかわりはありません。

まず細菌のＲＮＡポリメラーゼと真核生物のＲＮＡポリメラーゼ II を比較してみると、真核生物のＲＮＡポリメラーゼ II は細菌の酵素の構成要素である５つのサブユニットと相同のサブユニットを保持していて（α２：ＲＰＢ３＆ＲＰＢ１１、β：ＲＰＢ２、β’：ＲＰＢ１、ω：ＲＰＢ６）、さらに７つのサブユニットが追加されたような構造になっています（１、図１。）

どうしてRNAポリメラーゼが巨大化したのか、その理由はゲノムのサイズが大きくなり、多種多様なタンパク質を適切な時期に発現させるという複雑なニーズに対応したものと考えたくなりますが、実は細菌よりゲノムサイズが小さめの古細菌（アーケア）のＲＮＡポリメラーゼの構造は、細菌の酵素より真核生物のＲＮＡポリメラーゼに圧倒的に近いということから（１，２）、この考え方は否定されます。古細菌は見た目は細菌と同じなのですが、生命現象の基幹的な部分が真核生物に近いという意味で、進化の最大の謎といっても過言ではありません。真核生物はこのグループから進化したと考えられていますが、その詳細は不明です。

古細菌も真核生物も構造は異なりますがクロマチンというＤＮＡを保護する重層的な３次元構造を持っているため（３）、そのような障害を乗り越えて転写を行うためにサブユニットが増加したという考え方は可能でしょう。また真核生物は細菌より古細菌と近縁な関係にあることのひとつの強力な証拠でもあります。真核生物のＲＮＡポリメラーゼ I および III は II よりもさらにサブユニットが増えており（１）、II を基本としてそこから派生したものと考えられます。

古細菌や真核生物においても転写に際しては細菌と同様なプロモーターが存在し、細菌の－１０領域の配列を進化の中で引き継いだと思われるＴＡＴＡボックスといわれる配列が存在します。この配列は厳密に指定されいるわけではありませんが、5'-TATA（A or T）A（A or T）G-3' のようにＴＡＴＡという配列を含むものが多く、ＴＡＴＡボックスとかＴＡＴＡエレメントなどと呼ばれています。

この配列は細菌ではシグマ因子が認識するわけですが、古細菌や真核生物ではＴＢＰ（TATA binding protein）という転写因子が認識します。ＴＢＰはＲＮＡポリメラーゼのサブユニットではなく、真核生物の場合、ＴＦＩＩＤという巨大な転写因子のサブユニットとして機能します（図２）。図２にみられるように、真核生物の場合細菌よりも多数のプロモーターが存在し、転写開始点をまたいでいるものや、転写開始点より下流にあるものもあります。実は真核生物の場合、転写開始点からすぐ ｍＲＮＡ が読み取られるのではなく、ｍＲＮＡの塩基配列はかなり下流からはじまるので、このようなことが起こりうるわけです。

図２に示したように、それぞれのプロモーターにはその配列に結合する転写因子が存在し、ＧＣボックス－Ｓｐ１、ＣＡＡＴボックス－ＮＦ－Ｙ、ＢＲＥ（B recognition element）－ＴＦＩＩＢ、ＴＡＴＡボックス－ＴＢＰ、Ｉｎｒ（initiator element）・ＤＣＥ（downstream core element ）Ｉ～ＩＩＩ・ＤＰＥ（downstream promoter element）－ＴＦＩＩＤ などという組み合わせになっています。

当初すべての生物に普遍的に存在するＴＡＴＡボックス－ＴＢＰが特に重要と考えられていましたが、真核生物ではすべての遺伝子のうちＴＡＴＡボックスを持っているのは２０％以下という調査結果が報告されており（４～６）、さらに同じ生物の同じ遺伝子でも組織によって使用するプロモーターが異なるというデータもあります（７）。今までの知識を書き換える必要があります。

ＴＦＩＩＤはＴＡＦ１～１５とＡＦ４Ｂ・ＡＦ９Ｂ、そしてＴＢＰという多数のサブユニット（全部そろっているとは限らない）で構成される巨大な転写因子複合体で、転写開始に直接的にかかわっていると考えられます（８）。ＴＡＴＡボックスがなくＴＢＰを欠いている場合は、転写開始の位置が正確ではなくなり、複数の位置から開始される場合があることが知られています。実際に転写が開始される場合、ＴＦＩＩＤだけでなく、ＴＦＩＩＡ・ＴＦＩＩＢ・ＴＦＩＩＦなども加わって、さらに巨大な転写因子複合体を形成し、ＲＮＡポリメラーゼを所定の位置に配置した後、ＲＮＡポリメラーゼの一部をリン酸化することによって複合体から解離させて転写を開始させることになります（図３）。

真核生物の場合、ＤＮＡはヌクレオソームにまきつき（後の稿で述べます）、クロマチンという３次元構造をとっているので、それらをほぐさないと転写ができませんし、外部からの指令もさまざまな形できますので、ＴＦＩＩグループの転写因子複合体だけでは遺伝子発現の調節に対応できません。したがってＤＮＡが３次元的に折れ曲がっていることを利用して、遺伝子から離れた位置にあるプロモーターやエンハンサー配列に結合する因子なども遺伝子発現に影響を与えることができるようなシステムになっています。

このため遺伝子発現を調節するためのタンパク質複合体は数メガダルトンという巨大なサイズになることもあります（図４）。このようなシステムは細菌や古細菌にはありません。

このようにして転写は進みますが、どこかで終結させなければなりません。古細菌ではすでに細菌が行っているρ因子やステムループを用いる転写終結をやめていて（９）、真核生物も別のメカニズムで転写を終結させています（１０）。

真核生物の場合、例としてβ－グロビンの場合を図５に示してありますが、転写開始がｍＲＮＡの先頭からはじまるわけではないように、転写終結も終止コドンの位置で終わらず、さらに下流まで転写は継続します。そしてＡＡＴＡＡＡというポリＡ付加シグナルという塩基配列があると、その少し下流の転写終結シグナルＴＴＴＴ、ＴＴＧＣのところで転写は終結します。このあたりは厳密には指定されてはおらず、例えばポリＡ付加シグナルの何塩基下流でとか、終結シグナルがひとつでもあれば必ず止まるとかというわけではありません。実際ＴＴＴＴはスルーされています。転写されたＲＮＡ3'末端には、ポリＡポリメラーゼという特殊なＲＮＡポリメラーゼによって、鋳型なしにＡが連続的に付加されます（図５）。

転写されたＲＮＡをｍＲＮＡに加工するメカニズムは次稿で述べます。

参照：

１） Guy Drouin and Robert Carter, Evolution of Eukaryotic RNA Polymerases. eLS, DOI: 10.1002/9780470015902.a0022872
(2010).
http://www.els.net/WileyCDA/ElsArticle/refId-a0022872.html

２） 平田章, 古細菌の転写装置. 生化学　vol. 81, pp. 377-381 (2009)
こちら１

３） Tanaka T1, Padavattan S, Kumarevel T., Crystal structure of archaeal chromatin protein Alba2-dsDNA complex from Aeropyrum pernix K1. Jornal of Biological Chemistry, vol. 287, pp. 10394-10402 (2012), doi: 10.1074/JBC.M112.343210
http://www.riken.jp/pr/press/2012/20120224_3/

４） https://ja.wikipedia.org/wiki/TATA%E3%83%9C%E3%83%83%E3%82%AF%E3%82%B9

５） Civán P1, Svec M., Genome-wide analysis of rice (Oryza sativa L. subsp. japonica) TATA box and Y Patch promoterelements. Genome. vol. 52, pp. 294-297. doi: 10.1139/G09-001. (2009)
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19234558

６） http://www.osc.riken.jp/english/activity/cage/achievements/

７） Paul Gagniuc1 and Constantin Ionescu-Tirgoviste, Eukaryotic genomes may exhibit up to 10 genericclasses of gene promoters. BMC Genomics , vol.13, pp.512-527 (2012), DOI: 10.1186/1471-2164-13-512
こちら２

８） Robert K. Louder,  Yuan He, José Ramón López-Blanco, Jie Fang, Pablo Chacón & Eva Nogales , Structure of promoter-bound TFIID and model of human pre-initiation complex assembly. Nature  vol. 531, pp. 604–609 (2016)
http://www.nature.com/nature/journal/v531/n7596/abs/nature17394_ja.html

９） 房富 絵美子 他　古細菌型転写終結因子NusAの結晶構造解析及びRNA結合解析
こちら３

１０）杉本崇　真核生物mRNA３′末端プロセシング研究の新展開  生化学第８６巻第１号，pp. ７７~８０（２０１４）
こちら４

生物学茶話＠渋めのダージリンはいかが５２： 転写１

リボソーのところですでに述べたように、１９６０年頃にはすでにリボソームがタンパク質の製造工場であることはコンセンサスになっていました。トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）の役割もわかってきていました。すなわちリボソームに存在するＲＮＡの情報に基づいて、アンチコドンを持ちアミノ酸を運ぶ ｔＲＮＡが、順次リボソームにアクセスすることによって、タンパク質が合成されることになります。

しかし当初リボソームが持つＲＮＡは、それぞれのリボソームに特異的であり、そのリボソームがそれぞれ別々のタンパク質を合成するという考え方が一般的でした。この頃にはまだメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）という概念がなかったので、こういう考え方になるのも仕方ありません。メッセンジャーＲＮＡのところで、ブレナー・ジャコブ・メセルソンがＤＮＡからリボソームに情報を運ぶ不安定なＲＮＡが存在することを示唆する研究を行ったことを述べましたが、この１９６１年の研究を出発点としてＤＮＡからｍＲＮＡを合成するメカニズムの研究が進展しました。ＤＮＡを鋳型としてｍＲＮＡが合成されるプロセスを転写（transcription) といいます。

ただ彼らの実験でｍＲＮＡの構造と機能が明らかになったわけではなく、あくまでもこれは端緒にすぎません。マシュー・コブ は「誰がｍＲＮＡを発見したのか？」という科学エッセイを発表していますが（１）、どうも明快な結論はないようです。ニレンバーグとレダーは大腸菌の無細胞系（大腸菌をすりつぶした抽出液）に、ポリＵを入れるとフェニルアラニンがタンパク質にとりこまれることを証明しましたが、このポリＵはまさしくｍＲＮＡなわけで、ニレンバーグとレダーが発見者という見方もできます。

また後にニレンバーグとマタイは大腸菌の無細胞系にさまざまなポリリボヌクレオチドを投入して、タンパク質合成がこれらのポリリボヌクレオチドに依存していることをみています（２）。コブはブレナーらの実験と共にこの仕事を重視しています。

アヴィヴとレダーの実験も完成品の美しさがあります。彼らはうさぎのグロビン（ヘモグロビンを構成するタンパク質）のｍＲＮＡをオリゴｄＴセルロース法という方法を使って精製し、がん細胞をすりつぶした抽出液の無細胞系で、うさぎのグロビンを合成することに成功しています（３）。

大腸菌の無細胞系とファージを使った実験というのはユニバーサリティに欠けると思います。ファージは生物ではないという考え方もできます。グロビンｍＲＮＡの実験を行ったフィリップ・レダー（図１、1934～）は、ニレンバーグと共にコドンの最初の解読者であり、ｍＲＮＡの機能を確定し、グロビンの遺伝子が分断されていることをも発見した（４）という卓越した業績の研究者であるにもかかわらず、ノーベル賞は授与されていません。遺伝子の分断の件でも。ファージのグループが受賞して彼ははずされました。全く理不尽なことだと思います。

リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）やトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）が安定な物質であるのに対して、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は壊れやすい不安定な物質です。ｒＲＮＡ・ｔＲＮＡはハウスキーピングないつも必要なものであるのに対して、ｍＲＮＡは必要なときだけにあればよいものだという意味で、この違いは合理的です。たとえばラクトースが周りに豊富にあるときには、大腸菌はラクトース分解系のタンパク質をコードするｍＲＮＡが必要ですが、ラクトースがなくなれば必要ありません。ジャコブとモノーは、リプレッサーが通常はオペレーター領域に結合していて、ラクトースの存在によってリプレッサーとＤＮＡの結合が解かれ、ＲＮＡ合成がはじまることを示しましたが、これは最も単純な例であって、実際のＲＮＡ合成の制御機構ははるかに複雑を極めるものです。

ＤＮＡを複製するのはＤＮＡポリメラーゼであるのに対して、ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡを合成するのがＲＮＡポリメラーゼです。ＤＮＡポリメラーゼが dATP, dTTP, dGTP, dCTP を基質とするのに対して、ＲＮＡポリメラーゼは ATP, UTP, GTP, CTP を基質とします。ＤＮＡポリメラーゼが 3'OH を起点として必要とするのに対して、ＲＮＡポリメラーゼは必要としません。ですからＲＮＡポリメラーゼはＲＮＡ合成をはじめる基点を他の因子に決めてもらう必要があります。ＤＮＡポリメラーゼには多くの種類がありますが、ＲＮＡポリメラーゼは特殊なものを除いて細菌では１種類、真核生物では３種類しかありません。真核生物の３種類とそれぞれの役割は、ＲＮＡポリメラーゼ I：ｒＲＮＡの合成、ＲＮＡポリメラーゼII：ｍＲＮＡの合成、ＲＮＡポリメラーゼIII：ｔＲＮＡと一部のｒＲＮＡの合成となっていて、基本的に3種類のＲＮＡを分業で合成しています。

まず大腸菌のＲＮＡポリメラーゼについてみていきましょう（図２）。ＲＮＡポリメラーゼのコア酵素は５つのサブユニット（α、α、β、β’、ω）からなり、転写を開始する際にはσ因子が結合してホロ酵素の状態になります。σ（シグマ）因子が転写を開始する位置を指定します。細菌の場合、転写を開始する位置から上流側（鋳型鎖の３’側）に１０ヌクレオチドおよび３５ヌクレオチドあたりにσ因子と親和性の高い塩基配列（プロモーター配列、赤で示す）があり、σ因子はこのふたつのサイト周辺の塩基配列を認識してＤＮＡと結合し、ＲＮＡポリメラーゼが転写を始める位置を指定します。このふたつのプロモーターサイトは－３５領域、－１０領域と呼ばれます。

プロモーター配列は厳密に決まっているわけではなく、一例を挙げれば TGTTGACA（－３５領域）、TATAAT（－１０領域）などがあります。これらにσ因子が結合することによってＲＮＡポリメラーゼと隣接ＤＮＡの立体構造が変化して、閉じられていたＤＮＡの２重鎖が開いて、鋳型鎖の情報をＲＮＡポリメラーゼが読み取ることができる状況になります。そしてＲＮＡポリメラーゼは＋１の位置から転写を開始します（図３）。もちろんこのときリプレッサーはＤＮＡからはずれていなければなりません。

大腸菌は７種類のσ因子を持っていることが知られており、分子量に応じて分類されています（例えば分子量約７万のものはσ７０）。
σ１９、σ２４、σ２８、σ３２，σ３８、σ５４、σ７０のうち、通常はσ７０が使われています。σ２８は鞭毛専用。ヒートショックを受けた場合はσ２４・σ３２、飢餓の場合はσ３８など用途や状況によって使い分けているようです（５）。それぞれのσ因子によって、当然親和性の高いＤＮＡ塩基配列も異なります。単細胞の細菌でも７種類の転写部位を指定する因子があるわけですが、真核生物の場合このような細菌のやり方を拡張し、非常に複雑な転写指定を行うことによって細胞の多彩なニーズに対応するように進化しました。これについては後程述べます。

σ因子のはたらきで転写を開始したＲＮＡポリメラーゼですが、では転写を終結する位置はどのように指定されているのでしょうか？　これには２つの方法があって、ρ因子依存性と非依存性と呼ばれています（６）。ρ因子は図４Ａのように６個のρタンパク質がドーナツのように集合した因子で、Cが多い rut site という配列を認識してＤＮＡに結合し転写を終結させます。ただし詳しいメカニズムはわかっていないようです。ρ因子非依存性の終結メカニズムは、転写されたｍＲＮＡがヘアピンのような構造をとることがポイントです。このような部分的二重鎖をつくるために、ＤＮＡおよびｍＲＮＡの一部に回文構造（パリンドローム）が形成されています。回文とは「竹藪焼けた」のように前から読んでも後ろから読んでも同じと言う文章ですが、塩基配列でこのようになっている部分（図４Ｂ赤線）がなっていない部分を挟んで存在すると、図４Ｂ右側の図のようにヘアピン構造を形成します。

ヘアピン構造のあとにＵＵＵＵＵＵＵＵという配列がありますが、このような場合ＤＮＡとｍＲＮＡの親和性が弱いことがわかっており、転写終結後、ｍＲＮＡがＤＮＡから離れるために有効であると考えられています。ここで述べてきたのは細菌の転写機構のお話です。真核生物については次の稿で。

参照：

１） Matthew Cobb, Who discovered messenger RNA?,  Current Biology 25, R523-R532 (2015)
file:///C:/Users/User/AppData/Local/Microsoft/Windows/INetCache/IE/PVA09UPG/PIIS0960982215006065.pdf

２） M.W. Nirenberg  and J.H. Matthaei, The dependence of cell-free protein synthesis in E. Coli upon naturally occurring or synthetic polyribonucleotides. Proc Natl Acad Sci USA vol.47, pp.1588-1602 (1961)
https://www.pnas.org/content/47/10/1588

３） H. Aviv and P. Leder, Purification of biologically active globin messenger RNA by chromatography of oligothymidylic acid-cellulose. Proc Natl Acad Sci USA vol.69, pp.1408-1412 (1972)
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/4504350

４） Konkel DA, Tilghman SM, Leder P. The sequence of the chromosomal mouse β-globin major gene: Homologies in capping, splicingand poly(A) sites. Cell vol.15, pp. 1125–1132. (1978)
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0092867478900405

５） https://en.wikipedia.org/wiki/Sigma_factor

６） J.D. Watson et al. Molecular Biology of the Gene 6th edn. pp.394-395 (2008)

生物学茶話＠渋めのダージリンはいかが５１： オペロン説

フランソワ・ジャコブ（1920～2013、図１)がパリ大学の医学部に入学してしばらくした頃、ドイツでナチが台頭し、フランスに攻め込んでくる状況になりました。２０世紀における分子生物学の爆発的進展は、二重らせんのワトソン＆クリックと、岡崎フラグメントの岡崎以外は、多くはユダヤ人の業績なのですが、ジャコブもご多分に漏れずユダヤ人だったので、生命の危機を感じてロンドンに脱出しました。

しかし彼はそこで医学生として勉強を続けるのではなく、自由フランス軍の兵士として参戦する道を選び、衛生兵としてアフリカを転戦しているうちに負傷して入院生活をおくることになりましたが、回復後再び参戦し、今度はノルマンディー上陸作戦に参加しました（１）。ノルマンディーでの戦闘がどんなにすさまじいものだったかは、スピルバーグの「プライベート・ライアン　原題：Saving private Ryan」という映画をご覧になった方ならご存じでしょう（2－5）。

ジャコブはこの戦闘で爆弾の破片が１００個以上も体に突き刺さるという重傷を負い、九死に一生を得て野戦病院に収容され、戦争が終結してからパリに送られました。大学にもどるまでに治療とリハビリで４年もかかったそうです（6）。結局その後の研究も、体の中に摘出できなかった破片をかかえこんだままで行なわれました。

しかし長いブランクの影響は大きく、ようやく医師の資格は得たものの、臨床医としてやっていくモチベーションもなくしてしまい、軍隊時代の伝手でペニシリンセンターに就職して研究者としての道を歩み始めました。ところがそのセンターもまもなく倒産して路頭に迷ってしまいました。そしてまたなんとか伝手をたどってパスツール研究所にもぐりこみました。

ジャコブはルウォフの研究室に所属し、そこでモノーと出会うことになります。モノーも戦争中はレジスタンス軍の参謀としてパリで地下活動を行っていました。しかしジャコブの最初の重要な共同研究者はエリー・ウォルマンでした。エリーの両親ユージンとエリザベスは溶原性ファージ（細菌のＤＮＡに組み込まれるファージ＝プロファージ）を発見した研究者でしたが、実験室でゲシュタポに捕らえられ、アウシュビッツに送られてしまいました。エリーはそんな両親の衣鉢を継ぐために微生物の研究者になりました（7）。

エリーと共にジャコブは大腸菌に性因子が存在すること。それはオスの大腸菌の中で別荘のような小さな独立のＤＮＡとして存在し（現在はプラスミドと呼ばれている）、接合の際に本家のＤＮＡと共にメスに送り込まれるということを発見しました。このことが遺伝子の制御という生物学上の大問題を解決する糸口になろうとは、当初誰も考えていなかったのでしょう。

ジャコブと同じルウォフの研究室に所属していたジャック・モノー（1910～1976、図１)は、以前から大腸菌がラクトースを消化して栄養源とする過程を分析していましたが、大腸菌は普段はこのために必要な酵素をつくっていなくて、周りにラクトースが出現したときだけに合成するということを見いだしていました。ジャコブらの実験をみていたモノーは、ジャコブらと協力して、ラクトース分解酵素を合成できないメス株と合成できるオス株とを接合させ、オスのＤＮＡがメスに取り込まれる過程を追って酵素活性を測定しました。

そうするとメスに遺伝子が移転された途端に酵素活性が上がりますが、３０分後には活性が失なわれたのです。これはラクトース分解酵素とは別の因子がメスに存在し、この因子（リプレッサー）が酵素の発現を抑制したと想像されました。彼らはさらに研究を続けてオペロン説という遺伝子制御の基本となる理論を打ち立てました（8，9）。

オペロン説というのは図２Ａのように、ラクトースが無い状態ではＤＮＡにリプレッサー（緑）が結合していて、ＲＮＡポリメラーゼ（黄色）はプロモーターの位置にとどまり、ＤＮＡの情報を読み取れない状況にありますが、ラクトースが存在するとリプレッサーはラクトースと結合してＤＮＡから離れ（図２Ｂ）、ＲＮＡポリメラーゼは情報を読み取り始めるという機構です。しかもラクトースの代謝に必要な酵素やタンパク質の遺伝子はオペレーター部位を先頭に並んでいて、まとめて制御されています（10）。

ＤＮＡ上に並ぶ遺伝子６、７、８（図２）がコードするタンパク質はそれぞれ、β-galactosidase (遺伝子名LacZ)、β-galactoside permease（遺伝子名LacY）、β-galactoside transacetylase (遺伝子名LacA)です。β－ガラクトシダーゼはラクトースをガラクトースとグルコースに分解する酵素（図３）。β－ガラクトシドパーミエースはラクトースなどを細胞に取り込むための細胞膜のタンパク質、β－ガラクトシドトランスアセチラーゼはラクトースなどにアセチル基を転移する酵素です。

リプレッサーを精製し、それがオペレーター領域に結合することはローゼンバーグらによって後に確認されました（11）。オペロン説はもうひとつ重要な課題を提起しました。それはリプレッサーがラクトースを結合することにより構造変化をおこして、ＤＮＡとの親和性に変化をきたすという考え方で、これはアロステリック効果と呼ばれるタンパク質化学において重要なテーマであり、その後もこのラクトースオペロンにおけるリプレッサーを材料としても、現代に至るまで詳しく研究されています（12，13）。

オペロン説は複数の遺伝子がひとつのオペレーター領域で制御されていることが注目されたため、そのようなことがほとんどない真核生物を含めると意義が薄れた感もありますが、むしろ遺伝子はタンパク質をコードする領域だけでできているのではなく、「プロモーターやオペレーターなどの制御領域とセットとなって一人前」という概念を提供したことに意義があると思われます。ジャコブ・モノー・ルウォフは１９６５年度のノーベル医学生理学賞を受賞しました。

参照：

1）Francois Jacob - Biographical.
https://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/1965/jacob-bio.html

2）https://www.youtube.com/watch?v=82RTzi5Vt7w

3）https://www.youtube.com/watch?v=Chzhf7gQxIg

4）https://www.youtube.com/watch?v=5v45or8lFWg

5）https://www.youtube.com/watch?v=ji8fQUn0OQE

6）分子生物学の軌跡　野島博著　化学同人社刊　（２００７）

7）Rudolf Hausmann, To grasp the essence of life -A history of molecular biology. Kluwer Academic Publishers (2002)

8）Francois Jacob and Jacques Monod, Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins., J. Mol. Biol. vol.3, pp.318-356 (1961)

9）http://libgallery.cshl.edu/items/show/74013

10）https://en.wikipedia.org/wiki/Lac_operon

11）J M Rosenberg, O B Khallai, M L Kopka, R E Dickerson, and A D Riggs, Lac repressor purification without inactivation of DNA binding activity. Nucleic Acids Res. vol.4, pp. 567–572. (1977)

12）Robert Daber, Steven Stayrook, Allison Rosenberg, Mitchell Lewis, Structural Analysis of Lac Repressor Bound to Allosteric Effectors.　Journal of Molecular Biology, Volume 370,  Pages 609-619 (2007)

９）松下祐貴，島村香菜子，大石叡人，大山達也，栗田典之, ラクトースリプレッサーとDNA複合体へのアロステリック効果の解析：古典MD及びab initioフラグメントMO計算, 第37回情報化学討論会, P12, （2014）
https://www.jstage.jst.go.jp/article/ciqs/2014/0/2014_P12/_pdf

生物学茶話＠渋めのダージリンはいかが５０： ＤＮＡ修復２

ジャン・ジャック・ワイグル(1901～1968）はもともとはスイスでＸ線解析などをやっていた物理学者だったのですが、なぜか米国に渡って微生物学者になりました。彼は１９５３年に不思議な現象を発見しました。彼が培養していたラムダファージを紫外線で不活化し（=殺し）、それを紫外線を照射した大腸菌にとりこませると、ファージは再活性化される（=生き返る）のです（１）。

ワイグルが発見した現象は、その後数十年かけて徐々にその全貌は解明されつつあります。驚くべきことに、この現象は細菌からヒトを含む真核生物に連綿と受け継がれた「ＤＮＡ乗り越え修復 translesion DNA repair = TLS DNA repair」という機構に基づくものであることがわかりました。普段は隠れていたこの機構が、紫外線を照射されるという危機的な状況で表に現れ、生命を救うのです。ですからＳＯＳリペアなどともよばれていました。

図１に示すように、ＤＮＡ複製の際にＤＮＡに損傷が発生し、ＤＮＡポリメラーゼがその位置で停止してしまうと、そこから先のＤＮＡは複製されず、細胞はアンダー・コンストラクションの状態で死を待つことになります。通常２本鎖ＤＮＡの片側に損傷が発生した場合、その部分を切り取って、対面のＤＮＡ配列を利用して修復することができます（2）。しかしＤＮＡ複製の際には複製フォーク（レプリケーションフォーク）が形成されているため、損傷部位の対面配列は離れた位置にあり利用できません（図１）。

この問題を解決するために、細菌は「ＤＮＡ損傷乗り越え修復」という技を編み出しました。道で事故車が止まっていたときに、それをレッカー車で移動してから通過するのではなく、いったん歩道に乗り上げて事故車を通過するというような強引なやり方です。損傷部位に乗り上げたＤＮＡポリメラーゼIIIは離脱し、ＲｅｃＡというタンパク質がＡＴＰを使ってＲｅｃＡ複合体を形成すると共に、ＤＮＡポリメラーゼVと共同して損傷部位の対面のＤＮＡを延長します。

なぜこの酵素だと延長できるかというと、ＤＮＡポリメラーゼVは厳密にワトソンクリック型の対面ヌクレオチドを合成するのではなく、かなり特異性が低いという特徴をもっているからです。別の言い方ではフィデリティー（忠実度）が低いとも言います。ですから図２ー２または３にみられるようにＴに対してＧをもってきたりするわけです。

ですがフィデリティーの低さは逆に壊れているＴも壊れていないヌクレオチドと認識することができるという利点があります。このためＤＮＡポリメラーゼIIIが読めなくて停止するような場合（図２－１）でも、涼しい顔で通り過ぎることができるわけです。損傷部位を通り過ぎた段階でＤＮＡポリメラーゼＶはお役御免で、ＤＮＡポリメラーゼIIIにふたたびバトンタッチします（図２－４）。このプロセスを実行した結果間違った塩基配列が形成されたとしても、とりあえず細胞は死を逃れることができます。

ＤＮＡポリメラーゼVは忠実度の低い酵素なので、通常は使われないよう厳しく管理されています。大腸菌に紫外線を照射して数十分後にようやくこの「ＤＮＡ損傷乗り越え修復」という機能が発動します。つまり他の忠実性の高いシステムで修復を試みて、どうしても修復できない場合の最後の手段として使うという意味もあるようです。ＤＮＡポリメラーゼII や ＤＮＡポリメラーゼIV もＤＮＡ乗り越え修復の機能があるようですが、詳細は不明のようです（3）。

ＤＮＡポリメラーゼＶなどのＴＬＳポリメラーゼ（乗り越え修復ＤＮＡポリメラーゼ）は、細菌・古細菌で類似しているだけでなく、真核生物においてもその遺伝子構造が引き継がれており、ヒトも例外ではありません。このような祖先生物から複数の種に機能・構造が引き継がれている遺伝子をオルソログといいます。真核生物のＴＬＳポリメラーゼにはイオタ、エータ、ゼータ、カッパがあります。大腸菌のＰｏｌIV・ＰｏｌV、古細菌のＤｐｏ４、真核生物のＰｏｌイオタ・Ｐｏｌエータ・ＰｏｌカッパはＹファミリーとよばれるオルソログ、大腸菌のＰｏｌIIと真核生物のＰｏｌゼータはＢファミリーというオルソログのグループを形成しています（3）。

真核生物にもＤＮＡ損傷乗り越え修復を行う機能はあり、ＤＮＡポリメラーゼ　イオタ（ι）、エータ（η）、ゼータ（ζ）、カッパ（κ）などが関与しているようです。このほかにも２本鎖がどちらも切断されたときとか、組み替え修復などの機構を生物は持っていますが、ここでは触れません。

いろいろなＤＮＡポリメラーゼが話の中に出てきて混乱するので、大腸菌と真核生物の各種ＤＮＡポリメラーゼをリストアップして、簡単な解説をつけておきます。

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E.Coli（大腸菌）

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ＤＮＡポリメラーゼ I :

１９５６年に、アーサー・コーンバーグによって最初に発見されたＤＮＡポリメラーゼ。この酵素が働かなくても大腸菌は生存可能なので、ＤＮＡの複製に必須ではありませんが、このような株は紫外線の感受性が高いことが知られています。またこの酵素はＴＳＬ型ではないため、主に各種除去修復の際のＤＮＡ合成に関与していると考えらています。この酵素の特徴はエキソヌクレアーゼ活性（3'→5'）を持っていることで、そのことによって間違った塩基のペアができた場合、鋳型の上を逆走してそれらを分解し、ＤＮＡ合成をやりなおすことができます。これは校正機能とよばれています（4）。

また逆方向（5'→3'）のエキソヌクレアーゼ活性も持っているため、おしりでＤＮＡ合成しながら頭でＤＮＡ分解を行うことができます。したがって頭の位置にあるＤＮＡの断点（ニック）を、結果的に進行方向にずらしていくことが可能で、これをニックトランスレーションと呼びますが、この反応を行わせるときに放射性のヌクレオチドを入れておくと、ＤＮＡが放射能で標識されます。この機能を使えば手持ちのＤＮＡをとりあえず標識できるので、研究上便利です。

この酵素がなくても大腸菌は生存可能とはいえ、あった場合はＤＮＡの複製に関与すると言われています。ウィキペディアによるとＲＮＡプライマーが分解されたあとのギャップを埋めるのに使われるとされています。この酵素は真核生物のミトコンドリアに存在するＤＮＡポリメラーゼガンマとオルソログであり、Ａファミリーを形成します。

ＤＮＡポリメラーゼ II :

この酵素はＤＮＡポリメラーゼI と同様な校正機能を持っていて、しかも忠実度（フィデリティー）が非常に高いので、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩが正しいペア形成に失敗したときに修正する機能があるとされています。ラギング鎖のＤＮＡ合成を行なうとも言われています。ＤＮＡにクロスリンクができてしまったときの処理に働いているという説もあります。バックアップ用の酵素かもしれませんが、まだ未解明な部分が多いと思われます（5）。

大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩＩは古細菌から発見されたPol B1, Pol B3、真核生物の Polアルファ、Polデルタ、Polイプシロン、Polゼータなどとオルソログであり、Ｂファミリーを形成しています。細菌のＤＮＡ複製の主役はＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ（Ｃファミリー）なのですが、古細菌や真核生物はこれを没にして、Ｂファミリーの酵素群を主役に抜擢しています。

ＤＮＡポリメラーゼ III ：

トーマス・コーンバーグとマルコム・ゲフターによって１９７０年に報告されました。細胞増殖のために行われるＤＮＡの複製を担う酵素としては、はじめて発見されたＤＮＡポリメラーゼです。ＤＮＡ合成を行うために他の多くの因子とＤＮＡレプリソームという複合体を形成して働きます。3'→5'エキソヌクレアーゼ活性を持っており、校正機能があります（6）。

ＤＮＡポリメラーゼIIのところで述べたように、この酵素ファミリー（Ｃファミリー）は古細菌や真核生物では用いられていません。非常に完成度が高かったため、生物の変化に対応できなかった可能性があります。

ＤＮＡポリメラーゼIV：

ＤＮＡ損傷乗り越え修復を行なう酵素です。ＤＮＡ合成が途中で停止したような場合に大量に出現し、合成を完了させるための損傷乗り越え修復を行ないます。この酵素を欠損する株では、ＤＮＡの損傷をひきおこすような薬剤を投与した場合に、突然変異の確率が高まることが知られています（7）。

ＤＮＡポリメラーゼV:

ＤＮＡポリメラーゼIVと同様、ＤＮＡ損傷乗り越え修復を行ないます。IVと共にＹファミリーを形成し、古細菌や真核生物にも多くのオルソログが存在する大ファミリーです。Ｙファミリーの酵素は、忠実度を低くすることによって、鋳型（テンプレート）が損傷を受けてもＤＮＡ合成を継続させるのが仕事なのですが、それでも損傷を受けた鋳型に対して、正しい対面ヌクレオチドを選択するに超したことはありません。従って受けた損傷の形に応じて使う酵素を変えて、より正確な複製を行うために種類が増えたのかもしれません（8）。

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真核生物：

ＤＮＡポリメラーゼアルファ（α）：

プライメースと複合体を形成して、ＤＮＡ合成をスタートさせる役割を担っています。プライマーの末端3'OHからＤＮＡ鎖を延長していきますが、２０ヌクレオチドあるいはそれ以内の鎖を合成したところで、デルタやイプシロンと交代します（9）。エキソヌクレアーゼ活性を持っておらず、校正機能が無いため、デルタやイプシロンほど正確な複製ができません。ＢファミリーのＤＮＡポリメラーゼです。

ＤＮＡポリメラーゼベータ（β）：

塩基除去修復に必要とされている酵素です。ＤＮＡポリメラーゼラムダやＤＮＡポリメラーゼミューと同じＸファミリーに所属します（10）。しかしラムダやミューはベータとは別の役割を果たしているようです（10）。細菌のＤＮＡポリメラーゼＸは研究が進んでいないようです。

ＤＮＡポリメラーゼガンマ（γ）：

ミトコンドリアに存在し、ミトコンドリアのＤＮＡ複製に関与すると考えられています（11）。大腸菌のＤＮＡポリメラーゼ I と同じＡファミリーに所属しています。ミトコンドリアは活性酸素が多い環境なので、ＤＮＡはダメージを受けやすく、この酵素が校正機能を持っていることには大きなメリットがあります。

ＤＮＡポリメラーゼデルタ（δ）：

ＤＮＡを複製および修復するときに用いられます。以前はラギング鎖のみ複製すると考えられていましたが、リーディング鎖の複製も行っているようです（12）。Ｂファミリーに所属し、校正機能を持っています。

ＤＮＡポリメラーゼイプシロン（ε）：

ＤＮＡを複製および修復するときに用いられます。主にリーディング鎖の複製を行っていると考えられますが、これはデルタで代用できるようです。しかしそれ以外に、２重鎖になっているＤＮＡをほどいてルーズな状態に変化させるＤＮＡヘリカーゼ（ヘリケース）を活性化する機能があり、これによって複製フォークが形成されるようで、こちらの機能は代替不可だそうです（13）。Ｂファミリーに所属し、校正機能を持っています。

ＤＮＡポリメラーゼ　ラムダ（λ）＆ミュー（μ）：

ＤＮＡの２本鎖が両方とも切れたときの修復（非相同末端結合）に使われるようです。また相同組み換えにも使われるようですが、まだ詳しく研究されていないようです（10）。いずれもＸファミリーに所属しています。

ＤＮＡポリメラーゼ　イオタ（ι）、エータ（η）、ゼータ（ζ）、＆　カッパ（κ）

いずれもこの記事で取り上げたＤＮＡ乗り越え修復に関与する酵素です。エータのようにチミンダイマーの対面をきちんとＡＡに修復できるエラーレスの酵素もあれば、エラーの確率が高い酵素もあります。ゼータはＢファミリーですが、他の３つはＹファミリーに所属します。

他にも特殊な酵素がいくつかありますが、ここでは述べません。文献（14、15）などを参照してください。

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参照：

1. J. J. WEIGLE, INDUCTION OF MUTATIONS IN A BACTERIAL VIRUS, Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol.39, pp.628-636
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1063835/pdf/pnas01592-0060.pdf

2. https://morph.way-nifty.com/lecture/2016/11/post-455d.html

3. M.F. Goodman and R. Woodgate, Translesion DNA polymerases., Cold Spring Harbor Perspectives in Biology, No.29, pp.1~20 (2016)
http://cshperspectives.cshlp.org/content/early/2013/07/08/cshperspect.a010363

4．https://en.wikipedia.org/wiki/DNA_polymerase_I

5．https://en.wikipedia.org/wiki/DNA_polymerase_II

6．https://en.wikipedia.org/wiki/DNA_polymerase_III_holoenzyme

7．https://en.wikipedia.org/wiki/DNA_polymerase_IV

8．https://en.wikipedia.org/wiki/DNA_polymerase_V

9. L. Pellegrini, The Pol alpha -primase complex. Subcell Biochem. vol.62, pp. 157-169 (2012)

10. J. Yamtich and J.B. Sweasy, DNA polymerase family X: function, structure, and cellular roles., Biochim Biophys Acta. vol.1804, pp.1136-1150 (2010)
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19631767

11. R. Krasich1, W.C. Copeland, DNA polymerases in the mitochondria: A critical review of the evidence. Frontiers in Bioscience, Landmark, 22, pp.692-709 (2017)
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27814640

12. R.E. Johnson, R. Klassen, L. Prakash, and S. Prakash, A Major Role of DNA Polymerase δ in Replication of Both the Leading and Lagging DNA Strands., Mol. Cell. vol. 59, pp.163–175. doi:10.1016/j.molcel.2015.05.038. PMC 4517859Freely accessible. PMID 26145172

13. T. Handa et al., DNA polymerization-independent functions of DNA polymerase epsilon in assembly and progression of the replisome in fission yeast., Mol Biol Cell, vol.23, pp.3240-3253 (2012), doi: 10.1091/mbc.E12-05-0339
https://www.bio.sci.osaka-u.ac.jp/newinfo/info72.html

14. 道津貫太郎、横井雅幸、花岡文雄、立体構造解析から見えてきた損傷乗り越えDNA複製の分子メカニズム. 放射線生物研究　vol. 46，pp. 1~14 (2011)
こちら

15. S. Doublie and K.E. Zahn, Structural insights into eukaryotic DNA replication. Frontiers in Microbiology. vol.5, pp.1~34 (2014)