生物学茶話＠渋めのダージリンはいかが４９： ＤＮＡ修復１

ＤＮＡはヌクレオチドがフォスフォジエステル結合を介して連結されていますが（図１）、このヌクレオチド同士の結合は化学的には非常に安定で、加熱・酸・アルカリなどの単独処理では壊れません。ジフェニルアミン法でのＤＮＡの化学的定量の際には過塩素酸の存在下でボイルして分解・染色します（１）。

しかし加熱・酸・アルカリには安定でも、生体内にはＤＮＡを切断・分解する酵素が存在するので安泰とは言えません。化石のDNAが分解されるのは、主として微生物の酵素によってです。また有機塩基は糖鎖やリン酸と比べると化学的に不安定で、加水分解でアミノ基がアンモニアとなってはずれてしまったり、塩基全体が糖からはずれてしまったり、アルキル化・酸化によって構造が変わったりします。これらの化学反応は酵素がなくても進行します。またＤＮＡを合成する際に、間違った塩基（ＧＣまたはＡＴというペアを形成しない）が取り込まれてしまうこともあります。

細胞が本来維持している環境の中でのエラーやダメージ以外にも、外界の放射線や紫外線によって発生するダメージも深刻です。生物は太古の昔から、このようなさまざまな要因によるＤＮＡの損傷を修復するべく知恵をしぼってきました。もちろんＤＮＡの変異が進化をもたらしたことは事実ですが、毎日起きているＤＮＡの損傷は桁違いで、ウィキペディアによると「ＤＮＡの損傷は、細胞内における正常な代謝の過程でも1細胞につき1日あたり 50,000～500,000 回の頻度で発生する」（２）となっています。

たった１ヶ所の変異によって、その部分の遺伝子情報によって作られている蛋白質の機能がゼロになったり、発がんの原因になったりすることもあります。ですから生物は様々なＤＮＡの救急システム＝ＤＮＡ損傷修復の機能を持っているわけですが、それ以外にも私たちの体を見てみると、生きている細胞が露出しているのは乳頭くらいで、あとは皮膚表層の死細胞が紫外線から生きている細胞を保護しています。またヒト以外の動物では皮膚に加えて毛皮や甲冑で保護している場合が多くみかけられます。

生物がまだ水中で生活していた頃は、水によって放射線や紫外線が遮蔽されるので、内因的な損傷だけを修復すればよかったのですが、陸に上がったとたんに外界から激しい損傷をうけることになるので、浅瀬で暮らしている時代に十分な準備をしておかないと、上陸は不可能だったでしょう。これは陸地を歩ける足を準備するのと同じくらい重要な段取りだったと思われます。

さて皆さんは昨年（２０１５年度）のノーベル化学賞を、どんな人が受賞したか覚えているでしょうか？　リンダール（1938～）・モドリッチ（1946～）・サンジャール（1946～）の３人です（図２）。

彼らは皆それぞれ別の様式のＤＮＡ修復に関する研究で受賞しました（３）。彼らが発見した３種類のＤＮＡ修復は、大腸菌（原核生物）もヒト（真核生物）も、関与する因子の名前こそ違いますが、様式は基本的に同じで、おそらく１０億年以上保存されてきたメカニズムだと思われます。生物は深海の熱水噴出口周辺で生まれたと思われますが、細菌はかなり早くから浅い海や地上で生きていたに違いありません。ですから彼らは優秀なＤＮＡ修復機構を太古の時代から持っていて、その後長い間海中で生活することになった真核生物も、彼らの業績を引き継いでいたということになります。

ここではノーベル賞を受賞した３人の科学者達の業績をたどってＤＮＡ修復の機構をみていきましょう。まずトマス・リンダールは塩基除去修復（base excision repair）という様式を発見しました（４）。例えばグアニン（Ｇ）が酸化されて８－オキソグアニン（Ｇ＊）に化学変化したとします（図３）。

まずこの異常な部位にグリコシラーゼがやってきて、異常な塩基である８－オキソグアニンと糖の結合を切断して、８－オキソグアニンを遊離させます。そうするとＤＮＡに塩基のない空白部分（ＡＰサイト、apurinic apyrimidinic site）ができます（図４）。この状態を認識するＡＰエンドヌクレアーゼというＤＮＡ分解酵素がやってきて、ＡＰ部位のＤＮＡを切断します（図４）。

ＤＮＡを切断する酵素を大きく分けると、一番端から順次内部に切っていく（鎖を短くしていく）酵素群をエキソヌクレアーゼ（exonuclease）と、鎖の内部を切断する酵素群（ＡＰエンドヌクレアーゼ AP endonuclease のように特定の部位だけ切断するものから、非特異的に滅多切りするものまでいろいろあります）があります。前者のエキソヌクレアーゼがＡＰエンドヌクレアーゼで切断されたＤＮＡの断端をみつけて、ひとつヌクレオチドを切り離します（図４）。このエキソヌクレアーゼはヌクレオチドひとつ分だけしか切りません。

ヌクレオチドが切り離されると、専門のＤＮＡポリメラーゼ（真核生物だとＤＮＡポリメラーゼベータ）がやってきて、鋳型に対応するヌクレオチドをひとつ 3'OH に結合させます。例によってこれを 5'P と結合させることはできないので、ＤＮＡリガーゼがやってきて結合し、元のＤＮＡへの修復が完成します（図４）。

次はアシス・サンジャールですが、彼はヌクレオチド除去修復（nucleotide excision repair）のメカニズムを解明しました（５、６）。彼はトルコでの裕福な医師生活を捨てて米国で勉強をやり直し、テクニシャンからはじめて、朝９時から深夜３時まで働くというハードワークで成功した人物です。

ヌクレオチド除去修復は、主にＤＮＡが紫外線によって損傷を受けた場合に発動します。紫外線がＤＮＡに照射されると、ＤＮＡの塩基配列上でチミンが二つ並んでいるところで、チミンダイマーが形成されます（図５）。

チミンダイマーが形成されると、周辺のＤＮＡにひずみが発生します。これをＵｖｒＡ＋ＵｖｒＢの複合蛋白質が認識し、ＡＴＰのエネルギーを使ってチミンダイマー周辺のＤＮＡを変形させて塩基同士の結合をひきはがします（図６－２）。するとそこにＵｖｒＣがやってきて、チミンダイマーの両側でＤＮＡを切断します（図６－３）。切断されるのはチミンダイマーの隣接部位ではなく、多少の余裕をみて数ヌクレオチド離れた場所で切断されます。チミンダイマーを含む単鎖ＤＮＡは遊離し、ＤＮＡにギャップが形成されます（図６－４）。この比較的広いギャップは、DNAヘリカーゼ（ヘリケース）によってＤＮＡポリメラーゼがアクセスできるように立体構造が整形され、真核生物の場合ＤＮＡポリメラーゼイプシロン（ε、リーディング鎖の複製を行なう酵素）によってＤＮＡ合成が行われ埋められます（図６－５）。最後にＤＮＡリガーゼによってＤＮＡの端部が連結されて修復が完了します（図６－６）。

ヌクレオチド除去修復に関連した因子が正常に機能しない場合、色素性乾皮症（xeroderma pigmuntosum）という生命に関わる重要な病気が発生することがあります。この病気は遺伝性で、患者さんは太陽に当たると癌が発生する危険性が高いので、一生暗い部屋で、外出するときは皮膚をすべて被うという気の毒な生活をしなければなりません。

最後はモドリッチですが、その前に一つ述べておかなければならないのは、すべての生物がＤＮＡの複製に用いている酵素であるＤＮＡポリメラーゼは種類も多くありますが、すべて１００％正確にＧ・Ｃ、Ａ・Ｔのルール通りのＤＮＡ合成が可能かというとそうではありません。確率は低いですがエラーが発生して、例えば図７のようにＧの対面が誤ってＴになったとします。このエラーを放置すると、もう一度細胞分裂が起こった場合、Ｔの対面はＡになって、ずっと先の世代まで間違ったＤＮＡが引き継がれることになります。このようなエラーの修復法をモドリッチが解明しました（７、８）。ミスマッチ修復法と呼ばれています。

ミスマッチが発生した場合、図７－１のようにＭｕｔＳαというタンパク質がその位置を検出し、結合するとともにＡＴＰを使って構造変化を起こしてＭｕｔＬαと結合します（図７－２）。ＭｕｔＬαはＤＮＡに断点をいれる酵素（エンドヌクレアーゼ）で、ミスマッチの両側にNick（断点）をつくります（図７－３）。次にExo1という断点から５→３の方向に順次ＤＮＡを分解していく酵素（エキソヌクレアーゼ）が、もうひとつの断点までＤＮＡを分解しギャップをつくります（図７－４）。真核生物の場合このギャップは主にＤＮＡポリメラーゼデルタがＤＮＡ合成を行うことによって埋められます（図７－５）。そして最後はＤＮＡリガーゼが 3'OH と 5'P を連結して修復は完了します。

以上３種類のＤＮＡ修復法について述べましたが、ＤＮＡの修復法は他にもあるので次回も続けます。

参照：

１）http://www.sci.keio.ac.jp/eduproject/practice/biology/detail.php?eid=00012

２）https://ja.wikipedia.org/wiki/DNA%E4%BF%AE%E5%BE%A9

３）DNA repair – providing chemical stability for life. THE ROYAL SWEDISH ACADEMY OF SCIENCES, 2015
https://www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2015/popular-chemistryprize2015.pdf

４）Tomas Lindahl, Instability and decay of the primary structure of DNA. Nature vol.362, pp.709-715 (1993)

５）http://www.newsobserver.com/news/local/education/article51568735.html

６）Sancar, A. and Rupp, W. D., A Novel Repair Enzyme: UVRABC Excision Nuclease of Escherichia coli
Cuts a DNA Strand on Both Sides of the Damaged Region, Cell vol. 33, pp. 249–260　(1983)

７）Ravi R. Iyer, Anna Pluciennik, Vickers Burdett, and Paul L. Modrich, DNA Mismatch Repair: Functions and Mechanisms. Chem. Rev., vol. 106,  pp. 302–323 (2006)
http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/cr0404794

８）Lahue, R. S, Au, K. G. and Modrich, P., DNA Mismatch Correction in a Defined System, Science, vol. 245, pp. 160–164 (1989)

生物学茶話＠渋めのダージリンはいかが４８： 岡崎フラグメント

岡崎令治氏（1930～1975、図１）は２０世紀の分子生物学の爆発的進歩に、戦後間もない日本（名古屋大学）で、日本人として最大の貢献を果たした科学者だと思います。広島に原爆が落とされたときに爆心地近傍で被曝されたとのことで、白血病で若くして亡くなったのは残念至極です。

奥様の恒子氏も科学者かつ共同研究者で、「岡崎フラグメントと私」という一文を生命誌ジャーナルに寄稿されています（１）。発見時の状況や苦労した点などを含めて記述されているので、ＤＮＡの複製に興味のある方は一読をお勧めします。もう少しアカデミックな記載としては、やはり岡崎恒子氏の「不連続複製機構を紡いだ日々」（２）という文献が、いまは亡き「蛋白質・核酸・酵素」という雑誌のバックナンバーに残されています。

生物は（ウィルスも生物だとすれば）一部のウィルスを除いて、すべて図２のようなレプリケーションフォークを作ってＤＮＡを複製します。ラジオオートグラフィーなどで巨視的に見れば、ＤＮＡはＹ型のレプリケーションフォークを形成しつつ、両鎖が同時に複製されるようにみえるわけです。

そこで図２Ａのように複製が行われるのであれば簡単なのですが、ひとつ問題があって、プライマーの 5'P 末端側からＤＮＡを伸ばしていくＤＮＡポリメラーゼがさっぱりみつからないのです。ＤＮＡポリメラーゼはどうも 3'OH を起点としてしかＤＮＡ合成を行えないとしか考えられません。

そこで岡崎らは図２Ｂのような複製様式を考えて（当時はプライマーの存在はわかっていなかったので、緑の線は後の知識を加えて描いたものです）、１９６６年に放射性チミジンが１０００～２０００ヌクレオチドの短いＤＮＡの鎖（後に岡崎フラグメントと呼ばれることになる）に取り込まれることを発表しました（３）。つまり微視的にみれば、片側の鎖は逆方向に短い鎖として複製され、あとでつながるという方式です。二股に分かれる部分が左方に移動した分だけの短いＤＮＡが漸次複製されるというわけです。

しかし複製中のＤＮＡを集めて単鎖に変性させると、多量のプライマーや岡崎フラグメントが採取できるかというと、そういうわけにはいきません。プライマーはどんどん分解され、ＤＮＡはどんどん接続されるので、無傷のプライマーや岡崎フラグメントは本当にわずかな量がわずかな時間にだけ存在するのです。

ここで救いの神となったのはＤＮＡを接続する酵素であるＤＮＡリガーゼの発見者である C. C. Richardson で、岡崎研にリガーゼが温度感受性となっているＴ４ファージの株をプレゼントしてくれたのです。その株で実験してみると、リガーゼが働かない高温条件だと、予想通りじゃんじゃん大量の岡崎フラグメントが発生し、温度を下げるとそれらはつながることが証明されました（４）。岡崎らはさらに両鎖とも 5'→3' 方向に鎖の伸長が進むことを示しました（５）。

あとひとつ解決しなければならないことは、最初に不連続複製のモデルを提出した頃にはわかっていなかったプライマーの問題なのですが、ここにいきつくまでに令治氏は他界し、恒子氏率いるグループに課題は残されました。

１９７９年に至ってようやく恒子氏のグループはプライマーＲＮＡの構造を解明し（６）、図３のようなＤＮＡ不連続複製の全貌が明らかとなりました。すなわちリーディング鎖ではＤＮＡの複製は連続的に行われ、ラギング鎖では逐次プライマーと岡崎フラグメント（a, b, c 等）が形成される逆方向の不連続複製が行われるということになりました。

ＤＮＡの２本の鎖はそれぞれ別の様式で複製されるため、３’末端から複製される鎖はリーディング鎖、５’末端から複製される鎖はラギング鎖と名付けられました。ラギング鎖においては、リーディング鎖とはことなり、逆方向から岡崎フラグメント（a, b , c) をつくりながら複製が行われます。逆方向とは言っても、鋳型（テンプレート）が逆方向なわけで、ＤＮＡを合成する方向としてはどちらも 3'OH を起点として５→３方向に進んでいるのです。

図３の状態からさらにプライマー（緑）を取り去り、できたギャップを埋め、ＤＮＡ鎖を接続するという作業が必要になります。これは概略図４のように行われます。図４におけるＤＮＡの塩基配列は説明のために記載した任意のものであり、実際の配列とは関係ありません。

１．岡崎フラグメント（矢印青）がＤＮＡポリメラーゼによって伸長されるとプライマー（緑）の 5'P 側とぶつかります。ＤＮＡポリメラーゼは伸長ＤＮＡ端の 3'OH とこの P を結合させることはできないので、ニック（切れ目）を生じたままそこで反応を停止します。

２．ＲＮａｓｅ ＨなどによってプライマーＲＮＡが分解されますが、ＲＮａｓｅ Ｈはリボースとリボースの結合しか切れないので、リボースとデオキシリボースが結合している最後の１ヌクレオチド（緑のドット）は処理できません。

３．最後の１ヌクレオチドは 5'P 側からリボースとデオキシリボースの結合を切るヌクレアーゼが作用して、もとプライマーがあった部分が完全なギャップとなります。

４．このギャップはＤＮＡポリメラーゼによって埋められますが（哺乳類の場合ＤＮＡポリメラーゼデルタ）、ＤＮＡポリメラーゼは 3'OH を認識してそこにヌクレオチドをくっつけていく酵素なので、赤矢印右端の 3'OH を既存の 5'P と接続することはできません。したがってニックができることになります。

５．このニックはＤＮＡリガーゼ（英語ではライゲース）によって接続され、岡崎フラグメントは解消されて、ラギング鎖の新生ＤＮＡは連結されます。

６．そしてプライメースによってプライマーがつくられ、そこからＤＮＡが合成され、１のステップにもどります。この１～６のステップを繰り返すことによって、ラギング鎖のＤＮＡ複製が行われます。

私はこの記事を書いていて、これまで岡崎令治氏は早逝されたのでノーベル賞を受賞できなかったと思っていたのですが、いろいろ難癖をつけられた岡崎フラグメントをさまざまな実験で世に認めさるとともに、ＤＮＡ合成の全貌を明らかにした功績から言えば、岡崎恒子氏の貢献が大きいと思いました。すなわち岡崎恒子氏（およびフラグメント発見論文のファーストオーサーである坂部貴和子氏）こそ受賞すべき人々なのではないでしょうか。

そしてもうひとつここでふれておきたいことがあります。ＤＮＡリガーゼは１９６７年に  Bernard Weiss と Charles Clifton Richardson　によって発見された、ＤＮＡの断点（ニック）を接続したり、ＤＮＡ同士を連結させる酵素です。 リチャードソンは現在もハーバード大学に研究室を構えているようですが、ワイスの消息は追跡できませんでした。リタイアしたのかもしれません。米国版も含めてウィキペディアへの記載もありませんでした。ＤＮＡを合成する酵素、ＤＮＡを切断する酵素については数人がノーベル賞を受賞していますが、ＤＮＡ合成のキーエンザイムであり、かつ遺伝子工学で頻繁に用いられるＤＮＡを結合させる酵素＝ＤＮＡリガーゼについては候補にもあがらないというのは不可解です。

参照：

１）「岡崎フラグメントと私」岡崎恒子、生命誌ジャーナル vol.9、no.3、pp.24-29 (2001)
http://brh.co.jp/s_library/interview/32/

２）「不連続複製機構を紡いだ日々」岡崎恒子、蛋白質核酸酵素　vol.48, no.6, pp.718-726 (2003)
http://lifesciencedb.jp/dbsearch/Literature/get_pne_cgpdf.php?year=2003&number=4806&file=usD0LKftXwfjSwF9ietppw==

３）K.Sakabe and R. Okazaki, A unique property of the replicating region of chromosomal DNA. Biochim Biophys Acta. vol.129, pp.651-654 (1966)

４）R Okazaki, T Okazaki, K Sakabe, K Sugimoto, and A Sugino, Mechanism of DNA chain growth. I. Possible discontinuity and unusual secondary structure of newly synthesized chains. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.59, pp.598-605 (1968)

５）T. Okazaki and R. Okazaki, Mechanism of DNA chain growth, IV. Direction of synthesis of T4 short DNA chains as revealed by exonuleolytic degradation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.64, pp.1242-1248 (1969)

６）T. Okazaki et al., Structure and Metabolism of the RNA Primer in the Discontinuous Replication of Prokaryotic DNA. Cold Spring Harb Symp

７）B Weiss and C C Richardson, Enzymatic breakage and joining of deoxyribonucleic acid, I. Repair of single-strand breaks in DNA by an enzyme system from Escherichia coli infected with T4 bacteriophage. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.57, pp.1021–1028 (1967)

生物学茶話＠渋めのダージリンはいかが４７： ＤＮＡ複製機構

「ＤＮＡの半保存的複製」のところで、１９５６年にアーサー・コーンバーグがＤＮＡの複製に関わる酵素ＤＮＡポリメラーゼを発見したことを述べました。世紀の大発見で、早くも１９５９年には彼にノーベル賞が授与されたくらいです。ところがそれから１０年経った１９６９年、ＤＮＡポリメラーゼ活性を失った大腸菌の変異株を分離したという驚天動地の報告が Nature 誌に発表されました（１）。これはアーサー・コーンバーグの酵素がなくても大腸菌は増殖できることを意味します。大ピンチに陥ったアーサー・コーンバーグでしたが、その後始末は息子のトーマス・コーンバーグや、共同研究者のマルコム・ゲフター、広田幸敬(1930～1986) らによって迅速に行われました。

ゲフターとトーマス・コーンバーグはすぐに、大腸菌抽出液中にアーサーが発見した酵素（ pol I ) 以外に２種類のＤＮＡ合成酵素があることを発見し、それらを精製して pol II, pol III と命名しました。当時広田はＤＮＡ合成に関する温度感受性変異株を多数分離しており、ゲフターとトーマスは広田との共同研究によって、それらの温度感受性変異株と pol I のダブルミュータントを解析しました。そうすると pol II はどの株でも正常でしたが、ある株で pol III が強い温度感受性を示しました。この株では pol III が高温によって変性してしまったために、ＤＮＡが複製できなくなったのです（２）。このことは pol III がＤＮＡ複製を担う酵素であることを強く示唆しましたが、この酵素単独では複製能力が低く、ＤＮＡの複製はそんなに簡単にいくものではない、すなわち未知因子がかかわっていることも示唆されました。

閑話休題、トーマス・コーンバーグはチェリストでもあり、著名なピアニストのエマニュエル・アックスとベートーヴェンのチェロソナタを見事に演奏している様子が YouTube にアップされています（３）。広田幸敬先生の講義は聴いたことがあります。気さくで親しみやすい方との印象でした。「大腸菌の性因子に関する研究が、ちょっとした差でジャコブの手柄になって非常に残念だった」というようなことを話されていたことを記憶しています。若くして亡くなられたのは誠に残念でした。

さて、ではＤＮＡ複製にどんな因子がかかわっているのでしょうか？　この後アーサー・コーンバーグ研究室のすさまじい逆襲がはじまりました。多くの有能な若手研究者や学生を集めて、毎月複数の論文が出版されるほどの精力的な研究が進められました。しかもジェラルド・ハーウィッツの研究室も同じテーマに小うるさく参戦してきました。

彼らはまず試験管内無細胞系のＤＮＡ合成システムを完成させました。温度感受性変異株は高温下ではこのシステムでも当然ＤＮＡ合成はできません。これに正常株の抽出液を加えるとＤＮＡ合成は回復します。そこで正常株の抽出液をクロマトグラフィーなどによって幾つかの画分に分け、どの画分を加えると回復するか調べます（相補性テスト）。これを繰り返すことによって画分に含まれる成分は減少し、最終的にある精製された１種のタンパク質を加えると回復するということが判明します。別の株で同様な操作を行うと、また別種のＤＮＡ合成にかかわるタンパク質が精製されます。このような相補性テストで精製されたタンパク質はそれぞれ DnaX （X は任意のアルファベット）という名前が付けられ、それぞれの機能が解明されていきました。

なぜそんなに多くの因子が必要かということを考える前に、とりあえずＤＮＡポリメラーゼができることを図１に示します。ＤＮＡポリメラーゼは２重鎖と１重鎖の両方を部分を持つＤＮＡにしかアクセスできません。しかも短い方の鎖（プライマー）の ３'OH が末端でない方に露出している必要があります（図１）。

プライマーの３'OH末端、 鋳型（テンプレート）DNA、そしてデオキシヌクレオシド３リン酸が存在したとき、ＤＮＡポリメラーゼはデオキシヌクレオシド３リン酸からピロリン酸を切り離し、鋳型ＤＮＡに適合したデオキシヌクレオシド１リン酸の５'Ｐを３'ＯＨ末端に結合させて、ＤＮＡの鎖長をのばすことができます。これ以外のことはできません。鎖長を連続的に延長させるためには、もちろん dATP、dTTP、dGTP、dCTP の４種のデオキシヌクレオシド３リン酸が必要です。

ですから２重鎖だけのＤＮＡや１重鎖だけのＤＮＡがあってもこの酵素はＤＮＡ合成はできません。実際細胞内にはそのようなＤＮＡがまま存在するので（たとえば紫外線でＤＮＡが切れた場合とか、ウィルスが感染した場合とか）、意味のない、あるいは有害なＤＮＡをどんどん増やさないために、ＤＮＡポリメラーゼの機能が厳しく制約されていることには生理的意義があります。ただＤＮＡの損傷修復に用いられるＤＮＡポリメラーゼの中には、そのような制約を受けないものもあるようです。

図１ではＤＮＡになっていますが、実際にはプライマーは（驚くべきことに）通常ＲＮＡです。ですからプライマーをつくるプライメースはＲＮＡポリメラーゼの１種です。ＲＮＡポリメラーゼは一般的にプライマーを必要としない酵素です。ですから１本鎖のＤＮＡだけではどうすることもできないＤＮＡポリメラーゼに代わって２本鎖（ＤＮＡ・ＲＮＡのハイブリッド）をつくることができます。

ＤＮＡの複製は DnaX タンパク質群やさまざまな酵素などのお膳立てや後始末があって、はじめて可能になります。コーンバーグらが研究を続けていくと、pol III 以外の多くの種類のタンパク質や酵素がＤＮＡ合成にかかわっていることがわかってきました。ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ (pol III) 自体も、現在では多くのタンパク質が結合したＤＮＡポリメラーゼⅢホロ酵素のかたちで、ＤＮＡ複製を実行することがわかっています（図２　ウィキペディアより）。図２で pol III （コア酵素）は α と表示されています。

ＤＮＡは通常２重らせん構造をとっているので、上記したようにＤＮＡポリメラーゼがアクセスすることは不可能です。ですからまずＤＮＡの鎖をほどいて１本鎖の塩基側を露出させ、かつ酵素がアクセスするに十分なスペースをつくらなければいけません。

ＤＮＡはある決まった位置から複製が開始されます。開始位置領域には oriC という名前がつけられ、そこに大腸菌の場合８つの DnaA タンパク質の結合部位（ＴＴＡＴＣＣＡＣＡなど）が存在し、ここに DnaA が結合することによって、周辺に存在するＡＴリッチな部分の２重ラセンをほどき、DnaB と DnaC がアクセスできるようにします。DnaB (helicase) と DnaC は協力してＤＮＡの単鎖構造を安定化させ、ＤＮＡ複製のお膳立てをします（参照５、図３）。

こうして作られた ”アクセス可能な部位” にＤＮＡ複製酵素がやってきて、すぐに複製を開始するかというと、そのような生物は見つかってなくて、ほとんどの生物ではまずプライマーという短いＲＮＡ（生物によってはＤＮＡ）がRNAポリメラーゼによって作成され、そこを起点としてようやくＤＮＡ複製が開始されます（図１）。

大腸菌の場合、まず塩基の数にして１１±１のＲＮＡフラグメント（プライマー）がプライメース（primase）という１種のＲＮＡポリメラーゼによって作成され、その３’末からＤＮＡ複製がはじまります。

プライマーのＲＮＡフラグメントは後に別の酵素によって取り除かれます。この別の酵素というのが RNase H やアーサー・コーンバーグが発見したＤＮＡポリメラーゼ Ｉ（pol I）だとされています。このときには pol I はＲＮＡを分解する酵素としても働くという２面性を持った特異な酵素です。そうして取り除かれたあとの空白をＤＮＡで埋め戻し、最後に残された５'Ｐと３'ＯＨの断点をＤＮＡリガーゼ（DNA ligase）で接続してようやくＤＮＡ複製は完了します（５）。ＤＮＡの合成はＤＮＡ複製のときだけではなく、ＤＮＡがダメージをうけたときにも行われます。アーサー・コーンバーグの酵素はそのような際にはＤＮＡポリメラーゼとしても作用します。

大腸菌の場合ゲノムはサーキュラーで複製開始点はひとつですが（図３）、真核生物ではゲノムはリニアで多数の複製開始点があります（図４）。酵母で複製開始点を同定したデータをみますと、一定間隔であるわけでもないし、いっせいに複製が開始されるわけでもないようです（６）。ＤＮＡ複製が行われている部分のことを replication bubble とか replication eye などと呼ぶことがあります。

参照：

１）Paul de Lucia, John Cairns, Isolation of an E.Coli strain with a mutation affecting DNA polymerase. Nature vol.224, pp.1164-1166 (1969)

２）Malcolm L. Gefter, Yukinori Hirota, Thomas Kornberg, James A. Wechsler, and C. Barnoux. Analysis of DNA Polymerases II and III in Mutants of Escherichia coli Thermosensitive for DNA Synthesis. Proc Natl Acad Sci U S A. vol.68, pp.3150-3153 (1971)
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC389610/

３）https://www.youtube.com/watch?v=81rk7_I4-zY

４）http://www.sc.fukuoka-u.ac.jp/~bc1/Biochem/replicat.htm

５）Molecular Biology of the Gene. 7th edn., J.D.Watson et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (2008)

６）大阪大学大学院升方研究室　研究紹介
http://www.bio.sci.osaka-u.ac.jp/bio_web/lab_page/masukata/research/index.html

生物学茶話＠渋めのダージリンはいかが４６： リボソーム

ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、リボソームなどは生命現象を維持するために必須のアイテムであり、細菌からヒトまですべての生物が持っているものです。これらを使ってタンパク質合成を行うというやり方をはずれた生物は１種もみつかっていないので、地球上の生命体はすべて同じルーツという考え方には説得力があります。

リボソームの話に入る前に、生化学者にとっては今でも大切な細胞分画法について述べましょう。真核生物の細胞内には核・ミトコンドリア・葉緑体・ミクロソーム・リボソーム・リソソーム・細胞骨格など不溶性の構造体が数多く含まれます。

細胞をまずホモジェナイザー（図１、Wheaton  社のサイトより）を使って壊します。図１のホモジェナイザーは先端のテフロン部分が円柱状になっており、ダウンス型といいますが、その他先端のテフロンがボール状のポッター型もあります。

ガラス容器のなかに細胞懸濁液を入れ、ステンレス棒をテフロンブロックに埋め込んだベスルを、回転させたり上下にピストン運動させたりして細胞を壊します。

ガラス容器とテフロンの間にわずかな隙間があり、細胞のサイズや堅さに応じて、その隙間の幅を変えて使います。ガラスとテフロンの膨張率は異なるので、通常４℃で隙間の幅は設定されています。

ホモジェナイザーで作成した細胞破壊液を遠心機にかけて、沈殿と上清にわけ、上清をさらに強い遠心力を使って沈殿と上清にわけるというやりかたで、さまざまな細胞内構造体を分離するのが細胞分画法で、アルベール・クロード（1899～1983）が創始した方法です（図２、参照１）。

遠心力の強さ（＋遠心時間の長さ）によって、沈殿してくる細胞内構造体は変わります。上記の方法では、段階的に遠心力を強めて異なる細胞内構造体を採取できるようにしています。

リボソームは細胞分画法で得たミクロソーム画分にあります。

ジョージ・パラディー（1912～2008）は１９５５年に出版した論文で、電子顕微鏡を用いてリボソームを観察し、それがミクロソーム（エンドプラズミック・レティキュラム＝ＥＲ）に結合していることを報告しました（２）。

パラディーはルーマニア人ですが、米国ロックフェラー研究所のアルベール・クロード研究室のポストドクとなり、クロードが開発した「生物を電子顕微鏡で観察する手法」を発展させました。母国では現在でも切手になっています（図３）。

アルベール・クロードとジョージ・パラディーの師弟２人は、リソソームの発見者であるクリスチャン・ド・デューブと共に１９７４年度のノーベル医学生理学賞を受賞しました。

リボソームはタンパク質を製造する工場であり、巨大なＲＮＡと多数のタンパク質の集合体です。直径が２０～３０ｎｍくらいあるので、容易に電子顕微鏡で粒子として見ることができます（２）。リボソームは分子としては非常に巨大で、例えば真核生物では分子量４２０万というような値になるので、種類の違いやサブユニットの区別のためには通常沈降係数で表記されます。

沈降係数Ｓ＝Ｖｔ（沈降速度）／負荷された加速度、つまり遠心力を強くかけたときに沈降速度がどの程度増加するかという単位がＳ（スヴェドベリ）ということになります。細菌と真核生物のリボソームはいずれも鏡餅のように２つの分子集合体からなりますが、サイズや構造は微妙に異なっています（図４）。

例えば真核生物の６０Ｓサブユニットは５．８Ｓ、５Ｓ、２８Ｓの３種類のリボソームＲＮＡと４９種類のタンパク質で構成されています。他のサブユニットもすべてリボソームＲＮＡとタンパク質の複合体です。

ウィキペディアにでている立体構造の図などを見るとわかるように（３）、リボソームはリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）で構成された骨格に、さまざまなタンパク質が結合した複合体で、そのタンパク質の種類の多さからみても非常に複雑なメカニズムで稼働していることが想像されます。

しかもタンパク質合成にかかわっているタンパク質はリボソームを構成しているもののみではなく、フリーのものもあります。分子生物学の教科書「Molecular  Biology of the Gene　(Cold Spring Harbor Press)」  でも、リボソームにおけるタンパク質合成のメカニズムについて数十ページを費やしているくらい複雑で、ここですべて説明するのは無謀です。詳しく勉強したい方は上記の教科書を読むか、無料の論文なら参照（４）を推奨します。

キーポイントだけ述べますと、リボソームはｍＲＮＡをトラップするサイトと、ｔＲＮＡをトラップするサイトの２つのサイトがあります。さらに tRNA をトラップするサイトにはＰサイトとＡサイトという２種類のサイトがあります（図５）。

Ｐサイトにはポリペプチドを結合した ｔＲＮＡ がつながれています。Ａサイトにはアミノ酸をひとつ持った ｔＲＮＡ がやってきて、Ｐサイトのポリペプチドの根元にあるＣＯＯを攻撃して、ここにペプチド結合（ＣＯＮＨ）を作ります（５図左）。

その結果ポリペプチドはＡサイトの ｔＲＮＡ に移行し、Ｐサイトの ｔＲＮＡ はフリーになってリボソームから離れます（５図右）。すなわちポリペプチドの長さは１アミノ酸分だけ長くなります。そしてこの延長されたポリペプチドを持ったＡサイトの ｔＲＮＡ はＰサイトに移行し、ｍＲＮＡも１コドン分移動します。そしてまたＡサイトに新たな ｔＲＮＡ がトラップされます。

この反応をアニメ化したものがウィキペディア「リボソーム」の項目の最後にあります（５）。ちょっとコマ送りが早いですが、よくみるとポリペプチドの合成の様子をわかりやすく表現しています。

参照：

１）Albert Claude, THE CONSTITUTION OF PROTOPLASM. Science vol.97, pp.451-456 (1943)
https://www.ganino.com/games/Science/science%20magazine%201940-1957/root/data/Science_1940-1957/pdf/1943_v097_n2525/p2525_0451.pdf

２）George E. Palade, SMALL PARTICULATE COMPONENT OF THE CYTOPLASM. J.Biophysc. and Biochem. Cytol. vol.1, pp.59-68 (1955)
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2223592/pdf/59.pdf

３）https://en.wikipedia.org/wiki/Ribosome

４）Dmitri Graifer and Galina Karpova, Interaction of tRNA with Eukaryotic Ribosome. Int J Mol Sci. vol.16 pp.7173?7194 (2015)
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4425011/

５）https://ja.wikipedia.org/wiki/%E3%83%AA%E3%83%9C%E3%82%BD%E3%83%BC%E3%83%A0

生物学茶話＠渋めのダージリンはいかが４５： トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）

ＤＮＡが遺伝情報の本体で、それが ｍＲＮＡ として読み取られるというところまでとりあえずきました。では ｍＲＮＡ が持っている情報は、どのようにタンパク質とつながっているのでしょうか。タンパク質はアミノ酸が連結したものなので、合成されるときにどのような順にアミノ酸が連結されるのかが重要です。この ｍＲＮＡ が持っている順番の情報を、どうやってアミノ酸が連結する順番として反映するのかというのが難題で、これを解決するために生物はトランスファーＲＮＡ （ｔＲＮＡ）というギミックを生み出しました。ＤＮＡからｍＲＮＡをつくるプロセスを転写（transcription）、ｍＲＮＡからタンパク質をつくるプロセスを翻訳（translation）といいます。

特定のアミノ酸と結合し、タンパク質合成工場であるリボソームまでアミノ酸を運んで、ｍＲＮＡ に指定された順にリボソームに送り込む物質が存在しなければ翻訳を行うことはできません。

ポール・ザメクニック（Paul Zamecnik 1912～2009、 図１）らは、ラットの肝臓を使って試験管内無細胞系でタンパク質合成が行われる実験系を開発し、ＡＴＰの存在下で、各アミノ酸と結合する可溶性のＲＮＡが存在することを証明しました（１）。この可溶性ＲＮＡが現在トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）として知られているものです。

このような重要な発見であるにもかかわらず、ｍＲＮＡの場合と同様、ｔＲＮＡ の発見者にもノーベル賞は授与されませんでした。少なくとも、この研究の中心となったポール・ザメクニックには授与されるべきだったと思うのは私だけではありません（２）。

とはいえ ｔＲＮＡ の構造を解明したロバート・ホリー（図２）には１９６８年にノーベル賞が授与されています。ロバート・ホリーらが研究を始めた頃には、すでにザメクニックらによって、各アミノ酸は ｔＲＮＡ 末端のアデノシンに結合することがわかっていたので、構造が異なる ｔＲＮＡ がアミノ酸の種類だけ存在すると想像できました。つまりアラニンにはアラニン専用の ｔＲＮＡ、リジンにはリジン専用の ｔＲＮＡ　等々というわけです。

ホリーのグループはクレイグの向流分配法（３）を４年がかりで最適化することによって、さまざまな ｔＲＮＡ を分離することに成功しました。彼らは特にうまく分離できたアラニン－ｔＲＮＡをまず分析しました。１４０ｋｇのパン酵母から１ｇの精製されたアラニン－ｔＲＮＡを得るのに３年を要しました。１９６１年には、この ｔＲＮＡ は約８０個のヌクレオチドが連結した単鎖であることがわかりました（４）。ホリーらの仕事は、本格的な構造決定作業の前に、７年もの準備作業を要したわけで、その間の予算を維持するのが大変だったことでしょう。

彼らは精製したアラニン－ｔＲＮＡをＲＮＡ分解酵素で切断してフラグメントをつくり、カラムクロマトグラフィーで各フラグメントを分離して、それぞれの構造を決定しました。そしてついに１９６５年にアラニン－ｔＲＮＡの全構造を解明しました（５、図３）。すでに発表されいたＲＮＡの２次構造に関する FRESCO-ALBERTS-DOTY モデルを参考にアラニン－ｔＲＮＡの２次構造を描くと、美しいクローバーリーフ状の構造になりました。そしてその中央の葉の先端の３つの塩基がｍＲＮＡに対応することもわかりました。この３つの塩基はｍＲＮＡが指定するコドンの裏側の配列であり、アンチコドンと呼びます。その他のアミノ酸に対応する ｔＲＮＡ の構造も、その後次々と同様な方法で解明されました。

以前にＤＮＡは２重らせん構造をとるのに対して、ＲＮＡは基本的に単鎖と書きましたが、短い２重鎖をつくることは可能で、特に ｔＲＮＡ の場合には顕著です。これによって ｔＲＮＡ は複雑な構造をとることが可能です。トランスファーＲＮＡの一般的な構造を図４に示します。上方にアミノ酸の結合部位があります。下方の赤の部分のアンチコドンに対応したアミノ酸が結合します。おおざっぱには、２重鎖構造をとっている４本の幹と、単鎖の３つのループ、そして短い枝のような部分（ガンマ）からできています。

左側にＤループ、右側にＴ（またはＴΨC＝ＴプサイＣ）ループがあり、これらの構造の違いによって別々の酵素がそれぞれの ｔＲＮＡ にアクセスし、適切なアミノ酸を結合させることができます。下方のＡループ（アンチコドンアーム）にはアンチコドン領域があり、ここで ｍＲＮＡ のコドンを認識します。ここでコドンのリストを見て下さい（図５）。

ＤＮＡ・ｍＲＮＡは３つの塩基でアミノ酸を指定しており、４ｘ４ｘ４＝６４種類のアミノ酸に対応できますが、アミノ酸は２０種類ほどしかなく、複数のコドンがひとつのアミノ酸に対応するようにせざるを得ません。

たとえばフェニルアラニン（Ｐｈｅ）の場合、ＵＵＵとＵＵＣが対応します。ロイシン（Ｌｅｕ）の場合、ＣＵＵ・ＣＵＣ・ＣＵＡ・ＣＵＧ の４つのコドンが対応します。なかにはメチオニン（Ｍｅｔ）やトリプトファン（Ｔｒｐ）のように、対応するコドンがひとつしかないものもあります。

全体をみていくと、最初の２つの塩基は各アミノ酸に特異的であり、３つめはしばりがゆるくなっていることがわかります。コドンのなかにはアミノ酸を指定しないものが３つあり（ＵＡＡ・ＵＡＧ・ＵＧＡ）、これらはここでタンパク質合成を停止せよというシグナルのストップコドンになっています。

図６はＡループの先端のアンチコドン領域を示したものです。アンチコドンを形成する３つの塩基のうち２つは厳密なワトソン・クリック型の対応（ＡＵ・ＧＣ）なのですが、残りのひとつ（アンチコドン側からいえば１番目の塩基）はルーズになっており、たとえばイノシン（Ｉ）はＡ・Ｕ・Ｇ・Ｃのどれとも塩基対を形成できるので、ＧＵＡ・ＧＵＵ・ＧＵＧ・ＧＵＣのコドンに対して、アンチコドンはＩＡＣの１種類で対応し、バリンが指定されます。

このように生物はイノシンを用いるなどの巧妙な方法で厳密なワトソン・クリック型の塩基対を回避し、６４種（ストップコドンを除けば６１種）のコドンで２０種のアミノ酸を指定するという難題を解決しているのです。

酵母のフェニルアラニン ｔＲＮＡの塩基配列をウィキペディアからお借りしました（図７）。ｔＲＮＡはｍＲＮＡのようにＡ・Ｕ・Ｇ・Ｃだけからできているわけではなく、その他のいろいろな塩基を含んでいます。ｍはメチル化されていることを示します。Ψはシュードウリジンで、ウリジンとは構造が異なります（図８）。たとえばフェニルアラニン ｔＲＮＡはバリン ｔＲＮＡと間違えられると困るので、酵素が認識しやすいようにさまざまな修飾がほどこされていると考えられます。

ｔＲＮＡの 3'ＯＨ側の端は必ずＣＣＡという塩基配列になっています（図７）。この一番端のＡがついているリボースにアミノ酸が結合するわけです。ここにアミノ酸を結合させるためには、まずアミノ酸をアミノアシルＡＭＰにしなければなりません。すなわちアミノ酸　ＮＨ２－Ｒ－ＣＯＯＨ　を　ＮＨ２－Ｒ－ＣＯ－ＡＭＰという形にしなければなりません（アシル化とはＲ－ＣＯをくっつけること　この場合Ｒはアミノ酸の種類の数だけ存在）。この形になると以下の反応が可能となります。

ＮＨ２－Ｒ－ＣＯ－ＡＭＰ＋ｔＲＮＡ → ＮＨ２－Ｒ－ＣＯ－ｔＲＮＡ＋ＡＭＰ　
（アミノ酸－ＡＭＰ　＋　ｔＲＮＡ　＝　アミノ酸－ｔＲＮＡ　＋　ＡＭＰ）

この反応を触媒する酵素は、最低でもアミノ酸の種類の数だけ（２０種類以上）存在し、例えばアラニンｔＲＮＡには必ずアラニンを結合させるようになっています。この酵素はアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素と呼ばれますが、核酸の持っている情報を使ってタンパク質を合成するというのはすべての生物がやっていることなので、どの生物でも各アミノ酸に対応して最低２０種類はもっていなくてはいけません。これは無生物から生物が誕生する上で大きな壁で、ここを突破してはじめて生物なるものが登場し得たわけです。

こうしてできたアミノ酸－ｔＲＮＡがタンパク質製造工場であるリボソームに運ばれて、タンパク質が合成されます。その状況はウィキペディアでうまく表現されていたので、図９にコピペしておきます。リボソームについてはあらためて述べますが、とりあえずｔＲＮＡ（図ではＴＲＮＡと表記されています）がアミノ酸を運んできて、ｍＲＮＡの指示通りの順にリボソーム内でアミノ酸を結合させ、アミノ酸を手放したｔＲＮＡはまたリボソームから去って行くというメカニズムだと理解できます。

ｔＲＮＡの３Ｄ立体構造については、例えば文献６などに美しいイラストが掲載されています。

参照：

１）Mahlon B. Hoagland, Mary Louise, Stephenson, Jesse F. Scott, Liselotte I. Hecht, and Paul C. Zamecnik., A SOLUBLE RIBONUCLEIC ACID

INTERMEDIATE IN PROTEIN SYNTHESIS., J. Biol. Chem. vol.231, pp.241-257 (1958)

２）Thomas H. Maugh II, Dr.Paul Zamecnik dies at 96; scientist made two major discoveries.
http://www.latimes.com/nation/la-me-paul-zamecnik19-2009nov19-story.html

３）https://wikimatome.org/wiki/%E5%90%91%E6%B5%81%E5%88%86%E9%85%8D

４）Holley R.W., Apgar J., Merrill S.H., Zubkoff P.L. Nucleotide and oligonucleotide compositions of the alanine-, valine-, and tyrosine-acceptorsoluble ribonucleic acids of yeast. J. Am. Chem. Soc., vol.83:pp.4861～4862 (1961)
http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja01484a040)

５）HOLLEY RW, APGAR J, EVERETT GA, MADISON JT, MARQUISEE
M, MERRILL SH, PENSWICK JR, ZAMIR A.　STRUCTURE OF A RIBONUCLEIC ACID.　Science, vol.147, pp.1462-1465 (1965)

６）Masahiro Naganuma, Shun-ichi Sekine, Yeeting Esther Chong, Min Guo, Xiang-Lei Yang, Howard Gamper, Ya-Ming Hou, Paul Schimmel, and　Shigeyuki Yokoyama.　"The selective tRNA aminoacylation mechanism based on a single G・U pair".　Nature, 2014,　doi:10.1038/nature13440
http://www.riken.jp/pr/press/2014/20140623_1/

生物学茶話＠渋めのダージリンはいかが４４： メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）

１９５６年にエリオット・ヴォルキンとローレンス・アストラハン（Elliot Volkin and Lawrence Astrachan）は興味深い実験を行いました。

彼らによると、Ｔ２ファージを大腸菌に感染させる実験の際に培地に入れた放射性のリンをとりこませて、その後ＲＮＡを分析すると、大部分のＲＮＡには取り込まれないが、一部のＲＮＡには顕著に取り込まれるという結果になりました（１）。

その後彼らは研究を進めて、このリン酸をとりこんだＲＮＡの寿命は極めて短く、かつファージのＤＮＡと極めて塩基組成が似ていることを確認しました。

野村眞康らはこのＲＮＡがタンパク質製造工場の一部であるリボソームＲＮＡやアミノ酸を運ぶトランスファーＲＮＡとはサイズが異なり、マグネシウム濃度が高い場合はリボソームに結合しているが、マグネシウム濃度が低い場合は解離することを発見しました（２）。

シドニー・ブレナー（1927～）とフランソワ・ジャコブ（ 1920～2013）（図１）らは大腸菌を１５Ｎと１３Ｃの重い元素からなる培地で培養し、ファージに感染させてすぐ、１４Ｎと１２Ｃの軽い元素からなる培地に移しました。そうして作られたＲＮＡを超遠心分析装置で調べました。そうすると半減期が１６分で、軽い元素からなる新種のＲＮＡが合成され、これは重い元素からなる安定なＲＮＡが含まれるリボソームに結合することがわかりました。これこそがメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ)だったわけです（３）。

共同研究者のメセルソンはこの実験を行うために１３Ｃのガスをロシア（当時はソ連）からシビアな交渉を経て取り寄せ、炭酸ガスに変換したあと藻類に吸収させて、光合成によって大腸菌の培地に入れる素材を作ったそうです（４）。

この実験で、メッセンジャーＲＮＡの存在を証明したことは非常に重要な研究だと思いますが、なぜかブレナーとジャコブは別件でノーベル賞を受賞し、メセルソンに至っては、すでに述べたメセルソン－スタールの実験でＤＮＡの半保存的複製を証明したばかりか、メッセンジャーＲＮＡの存在を証明したのにノーベル賞をもらえなかったという気の毒な運命となりました。

ＤＮＡに含まれる有機塩基Ａ・Ｇ・Ｃ・Ｔは、Ｔ・Ｃ・Ｇ・Ａという新たなＤＮＡの鋳型になりますが、同時にＵ・Ｃ・Ｇ・ＡというｍＲＮＡの鋳型にもなり得ます。チミン（Ｔ）とウラシル（Ｕ）は５の位置にメチル基がついているかついていないかだけの違いです（図２）。

ＤＮＡとｍＲＮＡにはもうひとつ違いがあって、それは前者の骨格となる糖はデオキシリボースであり、後者はリボースであるということです。２の位置がＨかＯＨかという違いです（図３　青丸がＤＮＡに含まれるデオキシリボース２の位置のＨ、赤丸がｍＲＮＡに含まれるリボース２の位置のＯＨ）。ウラシルはチミンより不安定、リボースはデオキシリボースより不安定という化学的特性があります。

ＤＮＡが世代にわたって安定であるべきなのに対して、ｍＲＮＡはＤＮＡからその時に必要な情報を読み取るためのツールなわけですから、用が済めばすみやかに消滅することが望ましいのです。

シトシンはときどきウラシルに変わってしまうことがあって、もしＤＮＡの成分にウラシルがもともと含まれているとすると、ＤＮＡを修復するシステムが仕事を始めようとした際に、シトシンから変わったウラシルなのか、もとからあるウラシルなのか判別できず困ってしまいます。ＤＮＡにはウラシルがないと決まっていれば、問答無用にウラシルを除去してシトシンに変えれば良いのですから修復は可能です。このこともウラシルがＤＮＡに含まれないことの理由と考えられます。

ＤＮＡは特別な場合を除いて二重らせん構造をとっていますが、ｍＲＮＡは上記のような構造上の違いで通常一重鎖となっています。ｍＲＮＡが二重鎖になってしまうとリボソームに結合してタンパク質を合成することができなくなるので、一重鎖であることは重要です。

ＤＮＡ　→　ｍＲＮＡ　→  （リボソーム＆トランスファーＲＮＡと連携作業）　→　タンパク質

という基本的な情報の流れについての図式を描くことができます。後に詳述しますが、リボソームはタンパク質合成工場、トランスファーＲＮＡ(ｔＲＮＡ）はアミノ酸を運ぶ運搬体、ｍＲＮＡはＤＮＡからの情報の運搬体と、とりあえず理解しておいてください。

ＤＮＡがＤＮＡポリメラーゼという酵素によって複製されるように、ｍＲＮＡはＲＮＡポリメラーゼという酵素によってＤＮＡから読み取られます。このことを転写（トランスクリプション）といいます。その状況を図４に示しました。

ＤＮＡの二重らせんの一部がほどけて、そこからｍＲＮＡのリボンが伸びてくるというイメージです。伸びたｍＲＮＡのリボンはリボソームと結合してタンパク質合成に利用されます。細菌の場合はそうなのですが、真核生物の場合、ｍＲＮＡは核で加工された後、細胞質に送り出され、細胞質でリボソームと結合してタンパク質合成を行います。

図４は見てきたような話なのですが、１９７０年になって本当にそのような画像が電子顕微鏡によってキャッチされました（５、図５）。ＤＮＡの電子顕微鏡写真は特殊な方法によって撮影されますが、方法を開発した Miller Jr らの業績は素晴らしいと思います（５）。

これはまた後に出てきますが、ＤＮＡのすべてが遺伝子の情報で隙間無く満たされているわけではありません。実際には　中間部分－遺伝子－中間部分ー遺伝子という構造になっています。ｍＲＮＡは遺伝子の部分にしか対応していないので、ＤＮＡのすべての部分に対応した ｍＲＮＡが存在するわけではありません。しかし中間部分には遺伝子の発現を制御する領域などが含まれており、重要な部分も存在します。

参照：

１）Volkin E and Astrachan L. Intracellular distribution of labeled ribonucleic acid after phage infection of Escherichia coli. Virology Volume 2, Issue 4, pp. 433-437 (1956)

２）Nomura M., Hall B.D. and Spiegelman S. Characterization of RNA synthesized in Escherichia coli after bacteriophage T2 infection.Journal of Molecular Biology vol.2(5), pp.306-326 (1960)

３）Brenner, S., Jacob, F., & Meselson, M. An Unstable Intermediate Carrying Information from Genes to Ribosomes for Protein Synthesis. Nature 190, pp.576-581 (1961).

４）http://sickpapes.tumblr.com/post/51016848003/brenner-s-jacob-f-and-meselson-m-1961-an

５）O. L. Miller Jr., Barbara A. Hamkalo, C. A. Thomas Jr., Visualization of Bacterial Genes in Action. Science, Vol. 169, Issue 3943, pp. 392-395 (1970)
http://science.sciencemag.org/content/169/3943/392.full.pdf+html

生物学茶話＠渋めのダージリンはいかが４３： ＤＮＡの半保存的複製

ワトソン－クリック式ＤＮＡモデルをもう一度別の観点で図１（ウィキペディアより　以下同）に示します。中央にＡＴおよびＧＣの塩基対があり、両側にデオキシリボースがリン酸で連結された鎖（バックボーン）があります。この鎖の端の構造をみると、左側の鎖の上端はデオキシリボースの５の位置にリン酸がつながった形で終了し、右側の鎖の上端はデオキシリボースの３の位置に結合したＯＨで終了しています。そして下端は左鎖は３ーＯＨ、右鎖は５ーリン酸で終了しています。つまり鎖には方向性があり、両鎖の向きは逆になっています。

５－リン酸で終わっている方を５’エンド（５プライムエンド）、３－ＯＨで終わっている方を３’エンド（３プライムエンド）といいます。ＤＮＡは二重らせんの立体構造をとっていますが（図２）、しめ縄とは少し違って、ひと巻きごとに太い溝（major groove)と細い溝（minor groove)が交互に出現します。つまり二回り分がユニットとなって積み重なったような構造になっています。

必ずＡ－Ｔ、Ｇ－Ｃのペアで構成されているということは、遺伝にとっては好都合です。Ａの相方Ｔが細胞分裂で失われても、また相方Ｔを見つければ元の遺伝情報が保存されることが期待できます。

ＤＮＡを合成する酵素は１９５６年にアーサー・コーンバーグ（1918～2007　図３）によって発見されました（３）。この酵素は

ヌクレオシド３リン酸＋ＤＮＡ（ｎ）　→　ピロリン酸＋ＤＮＡ（ｎ＋１）　　ｎ：鎖の長さ

という反応を触媒します。ＤＮＡの末端にある３’ＯＨがヌクレオシド３リン酸にアタックしてピロリン酸を解離させ、残ったヌクレオシド１リン酸を３’ＯＨに結合させるわけです。これによってＤＮＡの鎖は１ヌクレオチド分だけ長くなり、繰り返しによってさらに長い鎖をつくることができます。この酵素の発見によってコーンバーグは１９５９年度のノーベル医学・生理学賞を授与されました。酵素の名前は DNA polymerase ということになりました。

ワトソン・クリックが受賞したのは１９６２年ですから、アーサー・コーンバーグの場合異常に早く受賞したことがわかります。ただコーンバーグの発見した酵素は、大腸菌のゲノムを複製する機能を持つ酵素ではなく、ＤＮＡに発生したエラーを修復する酵素だったのです。ゲノムを複製するメインの酵素は１９７２年になってから、次男のトーマス・コーンバーグによって発見されました（４）。本来なら親子でノーベル賞をもらうべきだったかもしれません。ちなみに長男のロジャー・コーンバーグは RNA polymerase の研究でノーベル化学賞を受賞しています。ＤＮＡの複製については別稿で詳述します。ここではメセルソンとスタールの歴史的な実験についてだけふれておきます。

Ａ－Ｔ、Ｇ－Ｃ塩基対の構造をもう一度みてみると（図４）、ＮとＮまたはＮとＯとの間に水素原子がはさまれています。このような化学結合を水素結合といいます。この化学結合をはがすために必要なエネルギーは、Ｎ－Ｈ・・・Ｏの場合８ＫＪ（ジュール）/モル、Ｎ－Ｈ・・・Ｎの場合１３ＫＪ/モルで（１）、共有結合の場合と比べて１～２桁くらい小さなエネルギーでひきはがせる弱い結合です。例えば水分子のＨとＯをはがすには、４６３ＫＪ/モルのエネルギーが必要です（２）。

弱い力で二本の鎖が結合しているのなら、何かジッパーのような機構でＤＮＡの二重らせんがはがされて一重となり、そこからまた相方のらせんが合成されて二重になることが証明されれば、非常に都合良く遺伝情報の複製が説明できます。このアイデアはロマンティックですが証明されなければなりません。

ＤＮＡの複製の様式には３つの可能性が考えられます（図５）。ひとつは分散型。両方の鎖に親由来の素材と新しい素材が併存する二重らせんが２本形成されることになります（図５Ａ）。半保存的複製では、すべて親由来の素材でできている単鎖とすべて新しい素材でできている単鎖がまきついてできた二重らせんが２本形成されることになります（図５Ｂ）。最後に保存的複製では、両鎖とも親由来のものと、両鎖とも新素材のものとの２重らせんが形成されます（図５Ｃ）。

メセルソン（1930～）とスタール（1929～）は大腸菌をＮ１５（重い窒素）の培地とＮ１４（普通の窒素）の培地でそれぞれ培養します（図６、参照５）。それぞれのフラスコから大腸菌を集めＤＮＡの重さを遠心分離で測定すると、Ｎ１５の培地で育てた場合は茶色で、Ｎ１４の培地で育てた場合はオレンジ色で表してありますが、当然Ｎ１５の場合の方が重くて下に沈みます。Ｎ１４の場合は軽いので上の方の画分に浮いています。

Ｎ１５の培地で育てた大腸菌を、Ｎ１４の培地に移して、２０分で１回細胞分裂を行うような条件で培養します。２０分経過した大腸菌のＤＮＡを分析すると、茶色の位置とオレンジの位置の中間の重さ（密度＝densityで測定）の位置（赤）にひとつのバンドが現れました。この結果、親由来のＤＮＡのみでできている茶色のバンドがないことが判ったので、保存的複製ではあり得ません。

次に４０分経過してからＤＮＡを分析すると、中間の位置のもの（赤）が５０％、軽い位置のもの（オレンジ）が５０％になりました。分散型の複製なら、すべてのＤＮＡは同じ重さ（密度）のはずなので、このように２本のバンドができることはあり得ません。

半保存的複製と考えると、図７の一番右側に示すように、２回細胞分裂が起こった場合、親由来素材と新素材が１：１の二重鎖が２本と、新素材のみの二重鎖が２本できるので、図６の実験の結果をうまく説明できます。

分散型複製あるいは保存的複製では、図７に示すようにこのような実験結果にはなりません。前者ではどんな場合もバンドは１本、後者では２０分では重（茶）１：軽（オレンジ）１、４０分では重１：軽３となり、中間の重さのもの（赤バンド）はできません（図７）。

このような結果から、メセルソンとスタールはＤＮＡの複製は半保存的に行われると結論しました。そしてジッパーの役割はＤＮＡポリメラーゼ（ DNA polymerase ）が果たすということになりますが、実際のメカニズムはＤＮＡポリメラーゼ以外にも多くの因子が関与していて、これについてはいずれ稿を改めて述べます。

メセルソンとスタールの実験結果は、ＤＮＡの構造が相補的な二重らせんであることとよく符合します。細胞が分裂するときには、ＤＮＡの２本鎖が１本鎖にわかれ、それぞれが相方のＤＮＡの鋳型になることによって遺伝情報の複製が行われると考えると、細胞増殖や遺伝という現象がうまく説明できます。

参照：

１）https://ja.wikipedia.org/wiki/%E6%B0%B4%E7%B4%A0%E7%B5%90%E5%90%88

２）http://mh.rgr.jp/memo/mq0110.htm

３）Arthur Kornberg. The biologic synthesis of deoxyribonucleic acid, Nobel Lecture, December 11, (1959)
http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/1959/kornberg-lecture.pdf

４） Kornberg T, Gefter ML. Deoxyribonucleic acid synthesis in cell-free extracts. IV. Purification and catalytic properties of deoxyribonucleic acid polymerase III.,  J. Biol. Chem. vol. 247 (17): pp.5369-5375 (1972)

５）Matthew Meselson & F. W. Stahl. "The Replication of DNA in Escherichia coli",Proc Natl Acad Sci USA,Vol.44,p.671-682 (1958)
https://en.wikipedia.org/wiki/Meselson%E2%80%93Stahl_experiment