やぶにらみ生物論４８： 岡崎フラグメント

岡崎令治氏（1930～1975、図１）は２０世紀の分子生物学の爆発的進歩に、戦後間もない日本（名古屋大学）で、日本人として最大の貢献を果たした科学者だと思います。広島に原爆が落とされたときに爆心地近傍で被曝されたとのことで、白血病で若くして亡くなったのは残念至極です。

奥様の恒子氏も科学者かつ共同研究者で、「岡崎フラグメントと私」という一文を生命誌ジャーナルに寄稿されています（１）。発見時の状況や苦労した点などを含めて記述されているので、ＤＮＡの複製に興味のある方は一読をお勧めします。もう少しアカデミックな記載としては、やはり岡崎恒子氏の「不連続複製機構を紡いだ日々」（２）という文献が、いまは亡き「蛋白質・核酸・酵素」という雑誌のバックナンバーに残されています。

生物は（ウィルスも生物だとすれば）一部のウィルスを除いて、すべて図２のようなレプリケーションフォークを作ってＤＮＡを複製します。ラジオオートグラフィーなどで巨視的に見れば、ＤＮＡはＹ型のレプリケーションフォークを形成しつつ、両鎖が同時に複製されるようにみえるわけです。

そこで図２Ａのように複製が行われるのであれば簡単なのですが、ひとつ問題があって、プライマーの 5'P 末端側からＤＮＡを伸ばしていくＤＮＡポリメラーゼがさっぱりみつからないのです。ＤＮＡポリメラーゼはどうも 3'OH からしかＤＮＡ合成を行えないとしか考えられません。

そこで岡崎らは図２Ｂのような複製様式を考えて（当時はプライマーの存在はわかっていなかったので、緑の線は後の知識を加えて描いたものです）、１９６６年に放射性チミジンが１０００～２０００ヌクレオチドの短いＤＮＡの鎖（後に岡崎フラグメントと呼ばれることになる）に取り込まれることを発表しました（３）。つまり微視的にみれば、片側の鎖は逆方向に短い鎖として複製され、あとでつながるという方式です。

しかし複製中のＤＮＡを集めて単鎖に変性させると、多量のプライマーや岡崎フラグメントが採取できるかというと、そういうわけにはいきません。プライマーはどんどん分解され、ＤＮＡはどんどん接続されるので、無傷のプライマーや岡崎フラグメントは本当にわずかな量がわずかな時間にだけ存在するのです。

ここで救いの神となったのはＤＮＡを接続する酵素であるＤＮＡリガーゼの発見者である C. C. Richardson で、岡崎研にリガーゼが温度感受性となっているＴ４ファージの株をプレゼントしてくれたのです。その株で実験してみると、予想通りリガーゼが働かない高温条件だと、じゃんじゃん岡崎フラグメントが発生し、温度を下げるとそれらはつながることが証明されました（４）。岡崎らはさらに両鎖とも 5'→3' 方向に鎖の伸長が進むことを示しました（５）。

あとひとつ解決しなければならないことは、最初に不連続複製のモデルを提出した頃にはわかっていなかったプライマーの問題なのですが、ここにいきつくまでに令治氏は他界し、恒子氏率いるグループにに課題は残されました。

１９７９年に至ってようやく恒子氏のグループはプライマーＲＮＡの構造を解明し（６）、図３のようなＤＮＡ不連続複製の全貌が明らかとなりました。すなわちリーディング鎖ではＤＮＡの複製は連続的に行われ、ラギング鎖では逐次プライマーと岡崎フラグメント（a, b, c 等）が形成される逆方向の不連続複製が行われるということになりました。

ＤＮＡの２本の鎖はそれぞれ別の様式で複製されるため、３’末端から複製される鎖はリーディング鎖、５’末端から複製される鎖はラギング鎖と名付けられました。ラギング鎖においては、リーディング鎖とはことなり、逆方向から岡崎フラグメント（a, b , c) をつくりながら不連続に複製が行われます。逆方向とは言っても、鋳型（テンプレート）が逆方向なわけで、ＤＮＡを合成する方向としてはどちらも 3'OH を起点として５→３方向に進んでいるのです。

図３の状態からさらにプライマー（緑）を取り去り、できたギャップを埋め、ＤＮＡ鎖を接続するという作業が必要になります。これは概略図４のように行われます。図４におけるＤＮＡの塩基配列は説明のために記載した任意のものであり、実際の配列とは関係ありません。

１．岡崎フラグメント（矢印青）がＤＮＡポリメラーゼによって伸長されるとプライマー（緑）の 5'P 側とぶつかります。ＤＮＡポリメラーゼは伸長ＤＮＡ端の 3'OH とこの P を結合させることはできないので、ニック（切れ目）を生じたままそこで反応を停止します。

２．ＲＮａｓｅ ＨなどによってプライマーＲＮＡが分解されますが、ＲＮａｓｅ Ｈはリボースとリボースの結合しか切れないので、リボースとデオキシリボースが結合している最後の１ヌクレオチド（緑のドット）は処理できません。

３．最後の１ヌクレオチドは 5'P 側からリボースとデオキシリボースの結合を切るヌクレアーゼが作用して、もとプライマーがあった部分が完全なギャップとなります。

４．このギャップはＤＮＡポリメラーゼによって埋められますが（哺乳類の場合ＤＮＡポリメラーゼデルタ）、ＤＮＡポリメラーゼは 3'OH を認識してそこにヌクレオチドをくっつけていく酵素なので、赤矢印右端の 3'OH を既存の 5'P と接続することはできません。したがってニックができることになります。

５．このニックはＤＮＡリガーゼ（英語ではライゲース）によって接続され、岡崎フラグメントは解消されて、ラギング鎖の新生ＤＮＡは連結されます。

６．そしてプライメースによってプライマーがつくられ、そこからＤＮＡが合成され、１のステップにもどります。この１～６のステップを繰り返すことによって、ラギング鎖のＤＮＡ複製が行われます。

私はこの記事を書いていて、これまで岡崎令治氏は早逝されたのでノーベル賞を受賞できなかったと思っていたのですが、いろいろ難癖をつけられた岡崎フラグメントをさまざまな実験で世に認めさせた功績から言えば、岡崎恒子氏の貢献が大きいと思いました。すなわち岡崎恒子氏（および発見論文のファーストオーサーである坂部貴和子氏）こそ受賞すべき人なのではないでしょうか。

そしてもうひとつここでふれておきたいことがあります。ＤＮＡリガーゼは１９６７年に  Bernard Weiss と Charles Clifton Richardson　によって発見された、ＤＮＡの断点（ニック）を接続したり、ＤＮＡ同士を連結させる酵素です。 リチャードソンは現在もハーバード大学に研究室を構えているようですが、ワイスの消息は追跡できませんでした。リタイアしたのかもしれません。米国版も含めてウィキペディアへの記載もありませんでした。ＤＮＡを合成する酵素、ＤＮＡを切断する酵素については数人がノーベル賞を受賞していますが、遺伝子工学で頻繁に用いられるＤＮＡを結合させる酵素＝ＤＮＡリガーゼについては候補にもあがらないというのは不可解です。

参照：

１）「岡崎フラグメントと私」岡崎恒子、生命誌ジャーナル vol.9、no.3、pp.24-29 (2001)
http://brh.co.jp/s_library/interview/32/

２）「不連続複製機構を紡いだ日々」岡崎恒子、蛋白質核酸酵素　vol.48, no.6, pp.718-726 (2003)
http://lifesciencedb.jp/dbsearch/Literature/get_pne_cgpdf.php?year=2003&number=4806&file=usD0LKftXwfjSwF9ietppw==

３）K.Sakabe and R. Okazaki, A unique property of the replicating region of chromosomal DNA. Biochim Biophys Acta. vol.129, pp.651-654 (1966)

４）R Okazaki, T Okazaki, K Sakabe, K Sugimoto, and A Sugino, Mechanism of DNA chain growth. I. Possible discontinuity and unusual secondary structure of newly synthesized chains. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.59, pp.598-605 (1968)

５）T. Okazaki and R. Okazaki, Mechanism of DNA chain growth, IV. Direction of synthesis of T4 short DNA chains as revealed by exonuleolytic degradation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.64, pp.1242-1248 (1969)

６）T. Okazaki et al., Structure and Metabolism of the RNA Primer in the Discontinuous Replication of Prokaryotic DNA. Cold Spring Harb Symp

７）B Weiss and C C Richardson, Enzymatic breakage and joining of deoxyribonucleic acid, I. Repair of single-strand breaks in DNA by an enzyme system from Escherichia coli infected with T4 bacteriophage. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.57, pp.1021–1028 (1967)