組織標本の作成 よもやま話 その２ パラフィンケーキの作成１

パラフィンケーキの作成１

十分に固定した試料はホルムアルデヒドの水溶液が全体に浸透していますが、これをそのままナイフで薄切することはできません。試料に含まれる水分をパラフィンにおきかえて、固いケーキのような形（写真）にしなければなりません。パラフィンとはほぼローソクと同じ物です。もちろんパラフィンでなくてもプラスチックなどでも良いのですが、光学顕微鏡用の試料の場合、薄切したあともう一度パラフィンを溶かして抗原抗体反応を行わせたり、染色したりなどの処理をして検鏡する事が多いので、キシレンで簡単に溶かせるパラフィンは便利です。

水分をエタノールに置き換え、キシレンに置き換え、最終的にパラフィンに置き換えて固めるという操作を行います。試料の固定の場合にもそうでしたが、ここでも試料のサイズが置き換えの時間に影響します。大きければ大きいほど時間がかかります。すべてのプロセスで大きい試料は不利となりますが、だからといって１立方ｍｍの試料がベストというわけではありません。３Ｄのうち１Ｄが１ｍｍの厚みなら、他は５ｍｍでも１ｃｍでもほぼ同じです。２Ｄが５ｍｍの試料なら、１ｍｍの試料にくらべて２５倍の領域が観察出来るわけですから、圧倒的に有利です。下記の処理時間は１Ｄが１ｍｍの場合です。２ｍｍの場合は処理時間は倍になります。

ホルムアルデヒドによる固定が終了した試料
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７０％エタノールに１時間以上浸す
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新しい７０％エタノールに代えて１時間以上浸す
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新しい７０％エタノールに代えて１時間以上浸す
（７０％エタノールは組織に大きな影響を与えないので、そのまま長期間保存することが可能です）
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８０％エタノールに２０分浸す
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９０％エタノールに２０分浸す
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９５％エタノールに２０分浸す
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９９．５％エタノールに２０分浸す
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新しい９９．５％エタノールに２０分浸す
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新しい９９．５％エタノールに２０分浸す
（研究用に１００％エタノールも販売されていますが、薬局方の無水エタノール（９９．５％）で十分です。１００％エタノールでも保管がよくないと、すぐに水を吸って使用出来なくなります）
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キシレンに１０分浸す
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新しいキシレンに１０分浸す
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新しいキシレンに１０分浸す
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ここで試料を小さなメッシュのかごのようなもの（カセット）に入れて、キシレン：パラフィン＝１：１のパラフィン溶液に浸します。温度は４０℃。３７℃だとパラフィンが析出する場合があります。

かごとは：http://www.sakura-finetek.com/product/category/siyaku/caset.html

浸す時間は１～２時間でよいのですが、朝から作業をはじめるとここで夜になるので、一晩４０℃のまま置いておきます。このときにヨーグルトメーカーを使うと便利です。例えばタニカのヨーグルティア。
https://tanica.jp/household-products/yogurtia/

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試料は５０％キシレン：５０％パラフィン液で置き換えられています。次にこれを１００％パラフィンに置き換えます。
パラフィンはキャンドル用ではなく、研究用のものがよいと思います。ケーキができればよいわけではなく、きれいに薄切できるものでなければ使えません。
例えば　http://www.funakoshi.co.jp/contents/571

パラフィンは溶ける温度によっていろんな種類がありますが、融点５５～５６℃くらいのものがよく使われます。
このタイプのパラフィンに置き換えるには６０℃のインキュベータが必要です。これが市販品は結構大げさなものが多くて、家庭用冷蔵庫くらいの巨大なものが一般的です。しかし自作または業者に作ってもらうことも可能ですし、お料理用のオーブンでも、温度計を入れて５８℃～６５℃くらいで安定していることが確認出来れば使えると思います。
試料をいれる容器はホーローのカップなどが便利です。カップは少なくとも３個は必要で、あらかじめすべてにパラフィンを投入し、オーブンの中にいれて暖めて液体にしておきます。

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サンプルをパラフィンに浸す（６０℃、２０分）
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新しいパラフィンに浸す（６０℃、２０分）
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新しいパラフィンに浸す（６０℃、２０分）
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あらかじめシャーレにパラフィンを入れてオーブンで温め溶かしておく。そこにカップの中から試料入りのかご（カセット）をひろって投入します。

さてここからがちょっとした勝負です（つづく）。