８６．ＰＣＲ

　ＰＣＲとはポリメラーゼ・チェイン・リアクションの略称で、ＤＮＡを大量に増やす方法です。痕跡的少量のＤＮＡでも検査に十分な量まで増やせるので、今では警察の捜査でも定番になるほど普及しました。本題に入る前に、少し歴史的経緯をみてみましょう。
　一般には大腸菌くらい簡単に培養できるのだろうと思われがちですが、昭和時代にはそういうわけにはいきませんでした。私が学生時代、同じ建物に微生物学教室がありましたが、そこには宇宙船のハッチのようなものがあって中に入ると数人が作業できるような部屋があり、各種実験器具、培地、シャーレ、Ｌブロス、ピペットなどが大量に積み重ねられていました。これは高温高圧で滅菌作業をするボイラー室でした。空気中には雑菌が浮遊しているので、これらを芽胞を含めて完全に死滅させるには高温高圧（たとえば１２１℃、２０分）で処理しなければいけません。上記の実験器具などは使う前にすべてこのボイラー室に入れて高温高圧処理します。
　ボイラー室を管理運営するためには、資格を持った技術員を雇用しなければなりません（１）。実験は普通の実験台ではできず、クリーンベンチという、外から雑菌が流入しないように空気の流れをコントロールした、巨大な無菌ボックスの中に手を突っ込んで行わなければなりません。現在では実験器具はすでに企業で滅菌した使い捨て製品を買って使う場合が多く、このてのプラスチック製品は使った後棄てるだけなので、よほど特殊な実験でなければボイラー室を使うことはなく、廊下の隅にでも置けるようなオートクレーヴ装置（高圧蒸気滅菌）で事足ります（２）。ただしクリーンベンチで仕事をしなければいけないことに変わりはありません。
　ですから当時の生命科学研究者にとって、大腸菌にプラスミドを入れて遺伝子を増幅させるという作業は、大がかりな設備が整った微生物学の研究室以外ではじめるには大きな壁がありました。増幅させたいのはＤＮＡという化学物質なので、なんとか細菌を使わず酵素を使ってやりたいと思うのは当然です。そこに登場したのがマリス（図８６－１、Kary Banks Mullis）でした。
　マリスはカリフォルニア大学バークレイ校で学位を取った後、カンザス大学の小児心臓病研究室のポストドクになり（１９７２年）、１９７５年までに２度離婚して仕事も辞めバークレーに舞い戻りました。バークレーでは最初の妻が経営するコーヒーショップで店長をやっていたそうです（３）。そんなある日、バークレー校時代の友人であるトーマス・ホワイト（図８６－１）と再会し、ホワイトの紹介でカリフォルニア大学サンフランシスコ校のポストドクになり、脳研究をはじめました。しかしそこも結局すぐにやめてしまい、困ったホワイトは自分が幹部社員であるシ－タス社に、技術員としてもぐりこませることにしました（３、４）。持つべきものは友です。

図８６－１　トーマス・ホワイトとキャリー・マリス

　マリスは著しく協調性を欠く性格で、会社でまわりと衝突をくりかえすやっかいものでしたが、ホワイトはあえてＤＮＡ合成室長に抜擢しました。ここでマリスはＤＮＡ合成自動化装置の製品化で貢献して、ようやく会社での自分の立場を確立しました。そうして１９８３年、有名な出来事が起こります。文献４の記述をあえて英語のまま引用します。

　In 1983, while driving along the Pacific Coast Highway 128 of California in his Honda Civic from San Francisco to his home in La Jolla, California, USA, Kary Mullis was thinking about a simple method of determining a specific nucleotide from along a stretch of DNA. He then, like many great scientists, claimed having a sudden flash of inspirational vision. He had conceived a way to start and stop DNA polymerase action and repeating numerously, a way of exponentially amplifying a DNA sequence in a test tube（４）.

　ドライブ中に突然あるアイデアが浮かんだというわけです。それはＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェイン・リアクション）法の根幹となるすばらしいアイデアだったのですが、マリスは相変わらず喧嘩をくりかえし、アイデアが採用されるどころか「早くクビにしろ」という多くの研究員からの要請がホワイトのもとに届く有様でした。
　ホワイトはそのアイデアを評価しましたが、実験が下手くそな上に室員との折り合いも最悪なマリスにまかせておいてはどうにもならないと考え、マリスを棚上げして、彼のアイデアを実現するプロジェクトを別の研究室で立ち上げました。そうしてからはランディ・サイキとスティーヴン・シャーフという優秀な研究者達が中心となって、順調に仕事は進み完成しました。
　論文のファースト・オーサーはマリスで、マリスがまとめる予定だったのですが、さっぱり論文を書かないので、結局１９８５年にサイキ（５）、１９８６年にシャーフ（６）が論文を書くことになりました。マリスがやっとこさ論文を書いたのはオリジナルペーパーというより実験技術の本で、１９８７年になってしましました（７）。そこまで待っていたらシータス社は特許をとれなかったでしょう。それでもマリスは１９９３年にノーベル化学賞を単独で受賞しました。マリスというのは本当にツキのある人です。
　ここでＰＣＲ法の基盤となるＤＮＡの性質を簡単に述べます。ＤＮＡの二重鎖は高温（図８６－２では９４℃）で解離し一重鎖となります。ゆっくり低温にもどすとアニーリングがおこって、再び二重鎖が形成されますが、急速に温度を下げると長いＤＮＡ鎖はアニーリングをおこしにくく、一重鎖のままとなります。ここに短いプライマーを投入すると相方の相補鎖より優先的にＤＮＡ鎖に結合することができます。

図８６－２　ＤＮＡの熱変成

　そこで一重鎖ＤＮＡをつくるべく５０℃～６０℃に急冷した後、プライマーを大過剰に投入してＤＮＡと結合させます（図８６－３）。プライマーとは鎖長が短い相補性ＤＮＡです（赤線　図８６－３）。一重鎖ＤＮＡが元の相方を見つけて二重鎖に戻らないうちに、プライマーが先に結合する条件をみつけることがポイントです。

図８６－３　プライマーを目的のＤＮＡと結合させる

　次に７２℃に温度を上げて高分子ＤＮＡのアニーリングを阻止しながら、ＤＮＡポリメラーゼと基質を投入してＤＮＡ合成を行わせます（図８６－４）。この温度でＤＮＡ合成を行わせるには、後述のＴａｑポリメラーゼという特殊な耐熱性のＤＮＡポリメラーゼが必要です。

図８６－４　高温でのＤＮＡ合成

　もともと生物が出現しはじめた頃の地球は高温で、当然その頃の細菌・古細菌は好熱性だったわけです（８）。そして現在でも一部の真正細菌や多くの古細菌は温泉などの高温環境で生活しています。しかしはるか昔の地質時代とはことなり、現在は芽胞という熱に強い特殊な仮死状態で生きている生物も多く、そのような生物では酵素がすべて耐熱性とは限りません。トーマス・ブロックとハドソン・フリーズ（図８６－５）はそんななかから、Thermus aquaticus　という至適増殖温度が７０℃～７２℃の真正細菌を分離しました（９）。これは当時としては驚異的な高温で生育する生物でした。しかもこの温度はＰＣＲ法を実行する上で都合の良い温度でした。
　アリス・チエン（図８６－５、現アリス・チエン・チャン）は Thermus aquaticus からＤＮＡポリメラーゼを抽出・精製し、これは後に学名の頭文字から Taqポリメラーゼと名付けられました（１０）。ブロック、フリーズ、チエンらはこんな面白いめずらしいものがあるよというような感覚で研究していたと思いますが、これが２０世紀でも指折りのイノベーションになるとは、全く予想していなかったでしょう。科学の進展はしばしば思わぬところからもやってくるというのは繰り返し述べているところです。

図８６－５　Ｔａｑポリメラーゼの発見と実用化に貢献した研究者達

　通常のＤＮＡポリメラーゼを使ってＰＣＲ法をやろうとすると、３７℃でＤＮＡ合成を行わなければならず、この間にもとの巨大分子であるＤＮＡのアニーリングがおこるために効率が下がり、さらにまずいことに９４℃に温度をあげるとＤＮＡポリメラーゼは失活します。そうすると１サイクルごとに酵素を新たに添加することが必要で、かつだんだん効率が悪くなるわけです。こんなところが誰もＰＣＲなどということを考えなかった理由なのでしょう。
　しかしＴａｑポリメラーゼを使うと状況は一変します。７２℃で絶好調、９４℃でも失活しないので酵素の添加は不要ですし、７２℃の反応では長鎖ＤＮＡのアニーリングはおこらないので、効率も落ちません。つまり温度をたとえば　９６℃→５６℃→７２℃→９６℃→５６℃→７２℃→　というように繰り返し変化させるだけで、魔法のようにＤＮＡが増幅されていきます（１１）。このようなことを考えると、Ｔａｑポリメラーゼの発見を差し置いて、マリスが単独でノーベル賞を受賞したことには疑問が感じられます。
　図８６－６をみていただくと２サイクル目で、目的のＤＮＡが１本鎖だけですが（緑）生成されていることがわかります。図８６－７の３サイクル目では８本生成される二重鎖ＤＮＡのうち、２本が目的ＤＮＡの二重鎖です（緑・緑）。いったん二重鎖目的ＤＮＡが生成されると次のサイクルではその二重鎖ＤＮＡ（緑・緑）が複製されます。こうして４サイクル目には１６本生成される二重鎖ＤＮＡのうち８本が目的の二重鎖ＤＮＡとなり、サイクルが進むにつれて目的ＤＮＡの純度は上がって、最終的にはそれ以外のＤＮＡは無視できるくらいの割合になります。
　図８６－６、図８６－７をじっくりとよく眺めてください。最初は様々なＤＮＡが合成されますが、同じことを繰り返しているうちに目的のＤＮＡ（緑）＝黒の元ＤＮＡを複製したもの、が自動的にメインになっていく。そう、まるで魔法のようなギミックに茫然とします。このプロセスを続けていくと、最終的にはほとんどが緑：緑の二重鎖ＤＮＡとなり、これが目的のＰＣＲ産物です。

図８６－６　ＰＣＲ法によるＤＮＡの複製Ｉ　サイクル１とサイクル２

図８６－７　ＰＣＲ法によるＤＮＡの複製ＩＩ　サイクル３

　先輩からはこのＰＣＲの作業をやるために、何時間トイレを我慢したというような話を聞かされました。３つのウォーターバスを用意して、それぞれ９６℃、５６℃、７２℃に設定し、やることと言えば、時間が来ると試験管をあっちからこっちのバス移動させるだけの作業を延々と繰り返すだけなのです。お疲れ様。
　しかし当然２～３年もすれば自動的に移動させる装置が発売され（図８６－８Ａ）、さらに同じ試験管の液体を極めて短い時間で温度変化させる新機軸の開発もあって、やがて水槽は不要となり、極めて小型の装置で作業を行えるようになりました（図８６－８Ｂ）。現在では生成したＤＮＡをモニターできるような光学系を装備したリアルタイムＰＣＲ装置が主流となっています（図８６－８Ｃ）。
　ＰＣＲが普及することによって、バイオテクノロジーの研究室や工場のみならず、科学捜査や感染微生物の同定など社会の様々な場面で、この技術が利用されるようになりました。本物のジュラシック・パークも開園できるかもしれません。

図８６－８　ＰＣＲ装置

　ひとつ気をつけなければならないのは、もとのサンプルに微量の目的とは異なるＤＮＡが混在していた場合、それも増幅されてしまうということです。生成物を電気泳動法などで解析すれば、何種類のＤＮＡが生成されたかわかります。エラーで実験失敗程度なら笑えますが、科学捜査の失敗や、思わぬ病原遺伝子の増幅などということがおこればしゃれになりません。

参照

１）2級ボイラー技士の合格率と資格取得後のキャリアアップ
https://www.sat-co.info/boiler-engineer
２）オートクレーヴ
http://www.zetadental.jp/category-1888-b0-%E3%82%AA%E3%83%BC%E3%83%88%E3%82%AF%E3%83%AC%E3%83%BC%E3%83%96.html?_ad=1&gclid=EAIaIQobChMIx5K-37OK1gIVywcqCh11wg9bEAAYASAAEgKsi_D_BwE
３）野島博著　「分子生物学の軌跡」　化学同人　（２００７）
４）Ma Hongbao, Development Application of Polymerase Chain Reaction (PCR), The Journal of American Science vol. 1, no. 3, pp.1-47 (2005)
５）Randall K. Saiki, Stephen Scharf, Fred Faloona, Kary B. Mullis, Glenn T. Horn, Henry A. Erlich, Norman Arnheim. "Enzymatic Amplification of β-globin Genomic Sequences and Restriction Site Analysis for Diagnosis of Sickle Cell Anemia" Science vol. 230 pp. 1350-1354 (1985).
http://www.sciencemag.org/site/feature/data/genomes/230-4732-1350.pdf
６）SJ Scharf, GT Horn, HA Erlich　"Direct Cloning and Sequence Analysis of Enzymatically Amplified Genomic Sequences" Science vol. 233, pp.1076-1078 (1986).
７）Mullis KB and Faloona FA  "Specific Synthesis of DNA in vitro via a Polymerase-Catalyzed Chain Reaction."  Methods in Enzymology vol. 155(F) pp. 335-350 (1987).
８）http://morph.way-nifty.com/lecture/2016/09/post-1be1.html
９）Brock, Thomas D.; Hudson Freeze (August 1969). "Thermus aquaticus gen. n. and sp. n., a nonsporulating extreme thermophile". Journal of Bacteriology. American Society for Microbiology. 98 (1): 289–297. PMC 249935 Freely accessible. PMID 5781580.
１０）A Chien, D B Edgar, and J M Trela., Deoxyribonucleic acid polymerase from the extreme thermophile Thermus aquaticus. J Bacteriol. 1976 Sep; 127(3): 1550–1557.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC232952/
１１）RK Saiki, DH Gelfand, S Stoffel, SJ Scharf, R Higuchi, GT Horn, KB Mullis, HA Erlich.,  Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase.,  Science  29 Jan 1988: Vol. 239, Issue 4839, pp. 487-491DOI: 10.1126/science.2448875