８５．ベクター

　ベクターというのはラテン語で運搬者という意味だそうです。分子生物学では主に遺伝子の運搬者という意味で使います。これまでの話で明らかなように、制限酵素で切断したＤＮＡは断点の周辺に相補的な構造ができるので、別々のソースから得た２本鎖ＤＮＡを同じ制限酵素で切った場合に、別々のＤＮＡであっても自在に接続できることがわかりました。ここですぐに思いつくのは遺伝子を細胞に導入したいということです。それによって人工的な「進化」が可能になります。ところがＤＮＡは簡単には細胞に入り込めません。これは当たり前で、ＤＮＡがどんどん細胞に入ってくれば、ウィルス感染の危機はもちろん、様々なタンパク質が野放図に合成される可能性があり、代謝のバランスが崩壊して生命を維持することができなくなると思われますし、例え崩壊しなくても種という概念が成立せず、生物のあり方が地球上の生物とは全く異なることになるからです。
　しかし、ひとつの遺伝子を細胞に導入するということは、未知遺伝子の機能をさぐるのはもちろん、「ある遺伝子を欠損した細胞に、もとのあるべき遺伝子を導入すると失われた機能が回復する」ということがわかれば、その遺伝子の機能を確認できるという目的も果たせますし、生物に新しい機能を付加するとか、細菌に有用なタンパク質を合成させるとか、遺伝子治療を行なうとかの野心的な目標も当然めざしたいわけです。
　そこでスタンレー・コーエン、ポール・バーグ、ハーバート・ボイヤーらが目を付けたのがプラスミドというＤＮＡです（図８５－１）。これは生物が本来持っているゲノム以外に、独立に増殖する機能を持って住み着いているＤＮＡで、原核生物には一般的に存在するものですが、酵母にも存在することが知られています。プラスミドは宿を借りているといっても、寄生虫のようなわるさはしませんし、むしろホストにとって有用な役割を果たしています。ですからホストによってそのＤＮＡはメチル化されて保護されており、ファージのように分解されることがありません。この意味では真核生物における共生に近い関係だと思われます。

図８５－１　プラスミドとは　　Ｆ因子は♂の細胞質にあり、Ｆ繊毛を作って♀をトラップし、♀にコピーを送り込んで♂化することができる
（♂♀は便宜的な用語）

　例えばコリシンというプラスミドはホストには無害で他の細菌を殺す物質の遺伝子ですし、Ｒ因子プラスミドは薬剤抵抗性をホストに付与します。Ｆ因子プラスミドはＦ繊毛を作り出す遺伝子を持っており、Ｆ繊毛でＦ因子をもたない細菌をひきよせて接合状態をつくり、複製したＦ因子や他のプラスミドを送り込むことができます（図８５－１）。Ｆ因子が細菌本体のゲノムに組み込まれるとゲノム自体が他の細胞に送り込まれることもあるので、これが細菌の有性生殖だとも言えますが、これは性をどのように定義するかによって考え方が変わります（１）。
　ベクターに送り込みたい遺伝子を含むＤＮＡを、その遺伝子の両側で制限酵素 EcoRI を使って切断すると、図８５－２のように ＡＡＴＴ－－－ＴＴＡＡ フラグメントができます。同じ酵素でベクターとして用いるプラスミドを切断して－－－ＴＴＡＡ　　ＡＡＴＴ－－－という断端を作成すれば、そこにアニーリングによってフラグメントを挿入することができます。

図８５－２　組み替え型プラスミドの作成

　アニーリングというのは、もともと二重鎖を構成していたＤＮＡが１００°Ｃで変性して一重鎖になったとしても、６０°Ｃくらいの温度を保つことによって、相補的な配列が水素結合をつくってもとの二重鎖にもどるという現象です。相補的付着末端一本鎖を持つ二本鎖ＤＮＡ同士も、条件を最適化すれば同じメカニズムで付着末端同士で結合して、結果的に環状ＤＮＡをつくり、最後にＤＮＡリガーゼで３’ＯＨと５’Ｐをつないであげると、切れ目のない新しい環状二重鎖ＤＮＡを形成することができます（図８５－２）。
　この方法で、遺伝子をプラスミドに組み込むことができます。プラスミドは独自に複製を行うための複製開始点領域を持っていますが、それ以外に抗生物質耐性のゲノムを持たせておきます。こうするとプラスミドを増やしたときにその抗生物質の存在下で細菌を培養すると、抗生物質耐性の遺伝子を持つプラスミドを取り込んだ細菌だけが抗生物質の影響を受けずに増殖するので、プラスミドを取り込んだ細菌を見つけやすくなります。図８５－２ではテトラサイクリン耐性のプラスミドが用いられています。
　初期の組み換え実験に頻繁に用いられたベクターは、図８５－３のようなものです。ｐＢＲ３２２と名付けられましたが、ｐはプラスミド、ＢＲは写真のボイヤーの研究室で働いていたポストドクの　Bolivar　と　Rodriguez　の頭文字をとったものです。さまざまな制限酵素でそれぞれ１ヶ所で切断されるように設計されています。抗生物質耐性領域に断点があると、そこが切断された場合耐性が失われるので、２ヶ所に抗生物質耐性領域があります。図８５－３の場合アンピシリン（amp）とテトラサイクリン（tet）に耐性の領域左右にがあります。Eco RI または Nde I を用いた場合には、断点がこれらの領域の外なので、両方の抗生物質耐性領域が分断されることなく生きていることになります。

図８５－３　ベクターｐＢＲ３２２

　遺伝子操作においては、しばしばＤＮＡリガーゼという言葉が登場します。この酵素については私も何度か取り上げていますが（４－５）、基本的に図８５－４Ａの様に付着末端同士がくっついた状態で、最終的に３’ＯＨと５’Ｐを結合させて断点のないＤＮＡを完成させる役割をもっています。図８５－４Ｂのような平滑末端同士を結合させるのは苦手です。ところがヴィットリオ・スガラメッラ（６、図８５－４）らは、Ｔ４ファージのＤＮＡリガーゼはある条件で平滑末端を結合させることを発見したのです（７、図８５－４Ｂ）。

図８５－４　Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ

　細胞内では、しばしばＤＮＡの損傷や修復、ウィルスによるＤＮＡ合成などに伴って、不要なＤＮＡ断片が発生します。これらはすみやかにＤＮＡ分解酵素で分解してしまわなければいけません。このような浮遊するジャンクＤＮＡを、非特異的に結合して巨大ＤＮＡにしてしまうような酵素はあってはならないものです。実際に細菌や真核生物はこのような酵素を保持しませんが、ファージの中になぜかこのような酵素を持つ者がいたわけです。平滑末端同士を結合できる酵素がみつかったことは、遺伝子組み換えの作業には福音でした。

図８５－５　リンカーを用いた組み換えＤＮＡの作成

　例えば図８５－５のように Eco RI による切断部位を１ヶ所持つ短い鎖長のリンカーＤＮＡ（青灰色）を作成しておき、この断片を研究したいＤＮＡ（黄緑色）の両端に前述のＴ４リガーゼで接続して、その後 Eco RI で切断し、同様に Eco RI で切断したベクターとくっつけると組み換えＤＮＡが完成します（図８５－５）。こうして作成された環状組み換えＤＮＡは、基本的にプラスミドと同じなので、大腸菌に挿入して大腸菌を培養すると、自然にベクターも倍々ゲームで増殖し、したがって目的のＤＮＡを爆発的に増やすことができます。
　もうひとつ、奇妙な酵素について言及しなければなりません。それはターミナルヌクレオチジルトランスフェラーゼ（terminal deoxynucleotidyl transferase）という酵素で、名前が長いのでよく ＴｄＴ という略称が使われます。この酵素は鋳型（テンプレート）非依存的にＤＮＡを３’ＯＨから延長するというユニークな機能を持っています。図８５－６に示したように、１本鎖または２本鎖でも３’ＯＨが突出したＤＮＡを延長するのが得意ですが（活性大　図８５－６）、平滑末端を持つ２本鎖の末端３’ＯＨからの延長も可能です（活性中）。５’Ｐが突出した２本鎖ＤＮＡの３’ＯＨから延長するのは得意ではありませんが、不可能ではないようです（活性小）。
　この酵素はＡＧＣＴをランダムに付加していくので、ＤＮＡを合成することはできても複製することはできません。しかし実験室では基質としてｄＡＴＰだけを与えることもできるので、こうするとＴｄＴはＡＡＡＡＡｎのように、ＤＮＡの末端にホモポリマーを付加していくような形での反応を行わせることができます（図８５－６）。そもそもなぜこんな奇妙な酵素が存在するのかということですが、哺乳類では抗体やＴ細胞抗原受容体の多様性を確保するために重要な役割を果たしているようです（８）。ＤＮＡ合成酵素とは本来ＤＮＡの複製や修復に使われるはずだったのですが、本来の役割とは全く異なる用途に用いられる・・・・・まさしく進化は「ケガの功名」を積み上げたものであることを教えてくれる酵素です。

図８５－６　ＴｄＴ（ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ）

　ポリＡとポリＴなど相補的ホモポリマーの親和性は高いので、これを利用して図８５－７のように組み換えＤＮＡをつくることができます。両端が平滑のＤＮＡにまずポリＡを結合させ、ベクターにはポリＴを結合させてアニールすると、組み換えＤＮＡが作成できます。ただＡおよびＴの数は同じにできないので、あとで調整が必要になります。予め塩基数が決まったホモポリマーを用意して、Ｔ４リガーゼで結合しても同様な実験ができます。制限酵素による切断部位からポリＡとポリＴを延ばすようにすれば、あとで制限酵素によって目的部位を切り出すこともできます。

図８５－７　ＴｄＴを用いた組み替えＤＮＡの作成

　ここまで述べてきた組み換えＤＮＡ作成技術の前提となる大腸菌にファージやプラスミドを導入する技術は、１９７０年にハワイ大学のモートン・マンデルと比嘉昭子によって開発されました。彼らは制限能（免疫能）のない大腸菌を、低温下で塩化カルシウム処理すると、外界のＤＮＡ断片を菌体内に取り込ませることができることを証明しました（９－１０、図８）。
　外界ＤＮＡを取り込めるようになった細胞をコンピテントセルといいます。コンピテントセルに組み換え型プラスミドを取り込ませ培養すれば増殖させることができます。取り込まなかった細胞を排除するには、たとえばアンピシリン耐性の遺伝子を持つプラスミドを取り込ませた場合、アンピシリンを培地に入れるとプラスミドを取り込まなかった細胞は死滅するので、取り込んだ細胞を選択することができます。
　モートン・マンデルと比嘉昭子の写真は、ウェブサイトを探しましたが、残念ながらみつかりませんでした。彼らが先鞭を付けたトランスフェクション（遺伝子導入）の技術は現在にもひきつがれ、さらに哺乳動物細胞や個体への遺伝子導入の方法が盛んに研究されています。

図８５－８　形質転換（ＤＮＡを細胞にとりこませる技術）

　プラスミドを使わず、バクテリオファージやウィルスを用いた遺伝子導入の手法があります（１１）。ラムダファージが最も有名です。ラムダファージのＤＮＡはファージの殻の中では線状なのですが、両端にＣＯＳという相補的な部位があり、大腸菌に感染すると環状化します（図８５－９）。このＤＮＡをベクター（コスミドベクター）として使いやすいように改変して使用します。
　プラスミドと比べてファージ（ウィルス）ペクターの欠点は、ファージ（ウィルス）の殻の中は狭いので、長いＤＮＡを組み込むとはいりきらなくなることです。このため増殖に必要がないファージの遺伝子の一部を切り取って短いベクターをつくり、ある程度長めの遺伝子でも組み込めるようにします（図８５－９）。ファージ（ウィルス）ベクターの利点は、トランスフェクションで苦労しなくても自動的にホストの細胞に侵入してくれることです。
　哺乳動物細胞への遺伝子導入については、未知遺伝子なら導入した遺伝子を発現させて機能を研究する、遺伝子発現を制御する機構について研究する、実験動物に変異遺伝子を発現させて遺伝病を発症させる、遺伝病の動物に正常遺伝子などを移入して治療するなどの研究が行われています。
　遺伝子導入の方法はいろいろあって、タカラバイオのサイトから図８５－１０にコピペしておきます（１２）。いろいろあるといっても、それは試験管の中での実験についての話であって、患者の遺伝子治療に使えそうなのは、今のところウィルスベクターを使う方法しかありません。

図８５－９　ラムダファージベクターを用いた細菌細胞への遺伝子導入

図８５－１０　哺乳類細胞への遺伝子導入

　ウィルスの場合、ウィルスの中に目的の遺伝子を入れさえすれば感染によって自動的に細胞にはいるので、遺伝子移入は容易なのですが、問題は安全性です。ウィルスもどきが体内で増殖したり、炎症を引き起こしたり、遺伝子発現に影響を与えて病気になるのではお話になりません。実際１９９０年代にはすぐにでも臨床に使えるような雰囲気でしたが、どうなったかというと、１９９９年にペンシルベニア大学で治療中の患者で、注入したアデノウィルスベクターによって全身性の炎症反応がおきて、患者が死亡するという事故が発生し（ゲルジンジャー事件）、さらに２００２年にはフランスで２名の患者が白血病を発症するなどの問題がおきて（１３）、一気に研究は停滞しました。フランスの事故の場合、レトロウィルスベクターが癌遺伝子の上流に導入されたために、癌遺伝子が活性化して発病したようです（１４）。医師・研究者が前のめりになりすぎた結果だと思います。　とはいえ、最近再び遺伝子治療（疾病の治療を目的として遺伝子または遺伝子を導入した細胞を人の体内に投与すること）の機運が盛り上がっています。まあ過大な期待はしないで研究の進展を見守りましょう（１５－１６）。

参考

１）プラスミドってなに？　
http://www.seibutsushi.net/blog/2008/07/513.html
２）Bolivar F, Rodriguez RL, Betlach MC, Boyer HW (1977). "Construction and characterization of new cloning vehicles. I. Ampicillin-resistant derivatives of the plasmid pMB9". Gene. 2 (2): 75–93. PMID 344136. doi:10.1016/0378-1119(77)90074-9.
３）Bolivar F, Rodriguez RL, Greene PJ, Betlach MC, Heyneker HL, Boyer HW, Crosa JH, Falkow S (1977). "Construction and characterization of new cloning vehicles. II. A multipurpose cloning system". Gene. 2 (2): 95–113. PMID 344137. doi:10.1016/0378-1119(77)90000-2.
４）ワイス博士の不遇　
http://app.cocolog-nifty.com/t/app/weblog/post?__mode=edit_entry&id=17207703&blog_id=203765
５）岡崎フラグメント
http://app.cocolog-nifty.com/t/app/weblog/post?__mode=edit_entry&id=86368774&blog_id=203765
６）Vittorio Sgaramella
http://www.scienzainrete.it/documenti/autori/vittorio-sgaramella
７）Sgaramella V, Van de Sande JH, Khorana HG., Studies on polynucleotides, C. A novel joining reaction catalyzed by the T4-polynucleotide ligase. Proc Natl Acad Sci U S A. 1970 Nov;67(3):1468-75. (1970)
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/5274471
８）Edward A. Motea and Anthony J. Berdis, Terminal Deoxynucleotidyl Transferase: The Story of a Misguided DNA Polymerase.,  Biochim Biophys Acta. vol.1804(5):  pp. 1151–1166. (2010)  doi:  10.1016/j.bbapap.2009.06.030
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2846215/
９）Mandel, M. and Higa, A. (1970). “Calcium-dependent bacteriophage DNA infection”. Journal of Molecular Biology 53 (1): 159-162. PMID 4922220.
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0022283670900513
１０）Akiko Higa,  Morton Mandel, Factors Influencing Competence of Escherichia coli for Lambda-Phage Deoxyribonucleic Acid Infection., Japanese Journal of Microbiology, Vol. 16, No. 4,  pp. 251-257 (1972)
https://www.jstage.jst.go.jp/article/mandi1957/16/4/16_4_251/_article/-char/ja/
１１）Ｒ. Ｗ. オールド、Ｓ.Ｂ. プリムローズ著　「遺伝子操作の原理」第５版　倍風館　（２０００）
１２）タカラバイオ　遺伝子導入実験ハンドブック
http://catalog.takara-bio.co.jp/PDFS/transgenesis_experiment.pdf
１３）小澤敬也　遺伝子治療テクノロジーの開発とその応用　ウィルス　vol.54, no.1, pp. 49-57 (2004)
https://www.jstage.jst.go.jp/article/jsv/54/1/54_1_49/_pdf
１４）島田隆　日本の遺伝子治療の課題　（２０１３）
http://www.mhlw.go.jp/file.jsp?id=146735&name=2r98520000033pt6.pdf
１５）市場調査レポート　2017年版 遺伝子治療薬の将来展望　Seed Planning
http://store.seedplanning.co.jp/item/9516.html
１６）ＣＡＲ－Ｔ療法　リンパ球バンク株式会社　（２０１６）
https://www.lymphocyte-bank.co.jp/blog/medicine/%EF%BD%83%EF%BD%81%EF%BD%92%EF%BC%8D%EF%BD%94%E7%99%82%E6%B3%95/