やぶにらみ生物論９５： クリスパー

遺伝病は遺伝子のたった一組の塩基対の異常によっても発生し、それが原因で落命するということもあり得ます。有名なのは鎌形赤血球貧血症で、一対の塩基対の異常によってヘモグロビンベータのグルタミン酸がバリンに代わり、ヘモグロビンの機能が低下して貧血になります。どの遺伝子のどの塩基対が変異をきたしても病気になる可能性があるので、遺伝病のバラエティは無数にあります。

これらの遺伝子を正常にもどして病気を治療するというのは、分子生物学者にとってのひとつの夢でした。当初考えられたのは、レトロウィルスベクターを使って正常な遺伝子を細胞に注入するというやり方でした。

しかしそこで予想もしなかった事態が発生しました。まず１９９９年にゲルシンガー事件というのがおこりました。患者のゲルシンガー氏の免疫系がベクターに異常に強い反応を起こして、患者が死亡してしまったのです。

２０００年代のはじめには、Ｘ連鎖重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ－Ｘ１）と呼ばれる疾患に対して、２０人の小児患者が遺伝子治療を受けましたが、そのうちの５人が白血病を発症し、１人が死亡するという事件が起きました。この原因は患者のゲノムに挿入された治療用遺伝子が「がん遺伝子」を活性化したためと考えられています（１、２）。現在ではレトロウィルスベクターのかわりに、より安全性を担保されたレンチウィルスベクターが用いられ、ウィルスベクターによる遺伝子治療が再出発しています（３）

しかしこのようなウィルスベクターによる治療にはいつくか問題点があります。ひとつは遺伝子が挿入される場所を指定できないので、何が起こるか判らないという怖さがあること。いまひとつはハンチントン病のように、変異遺伝子が生成する異常タンパク質が、正常なタンパク質の作用を妨害するような場合には無効であることです（４）。

したがって、そのようなウィルスベクターによる治療に危惧を抱いていたグループの中では、前稿でとりあげたカペッキやスミティーズの相同遺伝子組み換え技術によって、異常遺伝子を正常遺伝子に組み換えるという可能性を追求しようという機運がひろがっていました。

そもそも相同遺伝子組み換えというのは、真核生物では主に減数分裂の時におこる現象ですが、どのようなメカニズムで行なわれるのでしょうか？　このそもそも論に取り組んだのがジャック・ショスタクです。彼はテロメア・テロメラーゼ関連でノーベル賞を受賞しましたが、それ以外の仕事でもその天才ぶりを遺憾なく発揮しました。

ＤＮＡは常に放射線・紫外線・化学物質などにさらされており、日常的に損傷を受けています。損傷のタイプは大きく分けて二つあり、ひとつは１本鎖の切断で、これは修復機構が数多く知られています（５、６、図１）。いまひとつは２本鎖の切断で、１本鎖の切断の場合と異なり、断点でＤＮＡが生き別れてしまうおそれがあるという生命にとって極めて危険な状況が発生します（図１）。しかし生命はあえて損傷時以外にも、減数分裂時には染色体の組み換えを行なって、遺伝子のシャフリングを行なっています。そのためには２本鎖の切断と修復が必要です（図１）。

ショスタクらは１９８３年に、２本鎖切断を修復する機構のモデル（仮説）を発表しました（７、図２）。今見てみると非常に味わい深いモデルだと思いますが、発表された当時はあまりに都合の良いことを単純につなぎ合わせたような気がして、信じ難い感じがしました。多くの研究者が当時はそう思っていたのではないでしょうか。しかし現在では着々とその正しさが証明されつつあります（８）。

２本鎖の断点から、まず１本鎖が断点の５’側からエクソヌクレアーゼによってかじられ（タンパク質がとりつくスペースを空けるためでしょう）、かじられなかったもう１本の鎖にＲＡＤ５１（図２の赤丸）というタンパク質がとりつきます。これとＲＡＤ５４（図２のオレンジ楕円）などが協力して相同染色体の対応部位をさがしてとりつきます。ここで相同染色体にある塩基配列を利用して図２のような修復を行ないます。結果的に染色体の組み換えが行なわれていることに注意して下さい。修復に利用された相同染色体側から見れば、染色体の一部が切り取られて移動しただけですが、２本鎖切断を受けた側の染色体では、極めて複雑なプロセスがあることがわかります。このプロセスの全貌はまだ解明されていません。

重要なのは、生物が本来持っている遺伝子組み換え機構を発動するには、ＤＮＡ２本鎖切断、相同染色体、ＤＮＡ加工酵素、相同部位を探すために必要なタンパク質、の４者が必要だということです。

ＤＮＡの２本鎖修復が、切断を受けたＤＮＡ以外のＤＮＡを利用して行なわれることの証拠をはじめて示したのはマリア・ジャシンらでした。彼女らは１８塩基配列を認識して２本鎖ＤＮＡを切断する特殊なエンドヌクレアーゼをマウスに導入し（マウスにはこ１８塩基配列がないため、ずっと発現していても何もおこらない）、１８塩基配列をマウスゲノムに埋め込むとともに、この配列に相補的なＤＮＡ断片を供給すると、約１０％の細胞が相同組み換えによってＤＮＡを修復することができました（９）。

この記事「クリスパー」の主役であるジェニファー・ダウドナはショスタクの研究室で博士号を得ているので、当然相同遺伝子組み換えには関心を持っていたはずですが、ポストドクはコロラド大学のトム・チェックの研究室でリボザイムの研究を行なっていました。しかし彼女が就職してから最初に取り組んだのは、「細菌の免疫機構」というテーマでした。

参照（４）によると、２００６年のある日会ったこともないジリアン・バンフィールド（ジル）という研究者から電話がかかってきて、共同研究のオファーがあったそうです。よくわけがわからなかったそうですが、ダウドナはその熱意にほだされて会って話を聴くことにしました。ジルはあらゆる細菌ＤＮＡが規則的にとびとびに並んだクラスター状の回文反復配列を持っており、その反復配列の間に異なる配列がはさまれているという話をしました（図３、灰色部が反復配列、赤・青・緑がそれぞれ異なる配列）。

この回文反復配列は、もともと別の大腸菌遺伝子の研究をしていた石野良純がその隣接領域に発見して報告していたものです（１０、図３の赤枠の中）。当時はこの配列の重要性に誰も気づきませんでしたが、かなり後になって、この配列が多くの細菌・古細菌にみられるということをフランシスコ・モヒカらが報告しました（１１）。ウィキペディアによれば、配列決定された原核生物のうち真正細菌の４割と古細菌の９割に見出されているそうです。この配列は２００２年にルート・ヤンセンらによってＣＲＩＳＰＲ（クリスパー＝Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ　Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ　Ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ　Ｓｈｏｒｔ　Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ　Ｒｅｐｅａｔｓ）と命名され、この近傍にはＣＡＳ遺伝子群（ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｇｅｎｅｓ）が存在することも明らかになりました（１２）。




ダウドナがジルに会う少し前に、アレグザンダー・ボロティンらが、反復配列にはさまれた赤・青・緑のＤＮＡ領域（図３、図４）がウィルスの塩基配列とホモロジーがあることを発表していました（１３）。さらにジルはダウドナにマカロヴァらの最新の論文を見せ、そこにはクリスパーが細菌の免疫機構のひとつであることが示唆されていました（１４）。　ダウドナは自分がそれまで研究していたＲＮＡ干渉（ｍＲＮＡの相補配列をもつＲＮＡが転写を制御する機構）が、原核生物の免疫に関与しているという話に驚愕し、ただちに食いつきました（４）。ダウドナの本には、海中の細菌の４０％が毎日ウィルス感染によって死んでいると書いてあります。細菌にはすごい増殖能力があるので、ウィルス感染なんて「へ」でもないというわけにはいかないようです。

ちょうどその頃、ロドルフ・バランガウらはウィルス抵抗性を獲得した細菌のクリスパーを調べて、新規にそのウィルスのゲノム配列がスペーサー部にコピーされていることを発見し、クリスパーが細菌の獲得免疫をになう機構であることを証明しました（１５）。この免疫機構が素晴らしいのは、いったん獲得するとそれが子孫にも受け継がれるという点です。

２００８年になりスタン・ブロウンズらは、まずクリスパー全体が転写され、次に転写されたＲＮＡがリピート部分でＲＮＡ分解酵素によって切断されて、各スペーサー部分と相補的なＲＮＡ分子が生成されることを示しました（図４、１６）。この短いＲＮＡはウィルスゲノムと相補的な構造をもっているため、ウィルスを不活化することができると考えられます。しかしそのメカニズムはそのようなものなのでしょうか。最近の研究ではこのメカニズムは大きくわけて大腸菌などに適用される Ｉ 型と レンサ球菌などに適用される ＩＩ型があることがわかっています。

ダウドナの研究室では２０１１年頃までは主に特異性の低いクリスパー Ｉ 型について研究していたのですが、プエルトリコのカフェで偶然エマニュエル・シャルパンティエと出会って共同研究を始めた頃から、特異性の高い II 型の研究に重心を移しました（４）。エマニュエルは ＩＩ 型クリスパーシステムを持つレンサ球菌のＣＡＳ９を研究していて、この遺伝子の突然変異によって免疫機構が失われることをみつけていました。ダウドナ研ではエマニュエルの研究室の他各地から人材を集めてＣＡＳ９の機能分析を行ないました。中心となったのはダウドナ研のマーティン・イーネック（Martin Jinek) とシャルパンディエ研の クシシュトフ・チリンスキ（Krzysztof Chylinski）です（図５）。二人ともポーランド語を話せたので意思疎通はうまくいったようです。

当初はクリスパーＲＮＡとＣＡＳ９でファージＤＮＡを切断できると思っていたわけですが、実はそれ以外に ｔｒａｃｒＲＮＡ（ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ＲＮＡ）というもうひとつの役者が必要であることがわかりました。このＲＮＡはクリスパーＲＮＡと相補配列をもち、ハイブリッドを形成してＣＡＳ９を分解すべきＤＮＡの特定部位に導きます。ＰＡＭ配列という生物種や関連分子種によって異なる特異配列が誘導に介在しています。ＣＡＳ９がＤＮＡの２本鎖をこじ開けると、クリスパーＲＮＡがその片側と結合します。その状態でＣＡＳ９のふたつのヌクレアーゼサイトを同時に使って２本鎖の両方を同時に切断します（１７、図５）。

ダウドナ研で ｔｒａｃｒＲＮＡとクリスパーＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を人工ＲＮＡで接続し１分子（キメラ分子）に統合してもＣＡＳ９を切断部位に誘導できることが示され、図５のようにクリスパーをツールとして用いるときは、このようなキメラ分子を使うのが便利ということになりました（図５）。この人工キメラ分子はｓｇＲＮＡ（シングルガイドＲＮＡ）と名付けられました。

図６はクリスパーの基礎研究を主導した３人の女性研究者です。彼女たちは研究者としてのみならずマネージャーとしても一流で、多額の研究費を得て大規模な研究室を維持し切り盛りしています。ちょっとバークレイのダウドナ研のサイトをのぞいてみましたが（１８）、主要メンバーはほとんど中国系で驚かされます。まもなくノーベル賞を受賞しようかという研究室にもかかわらず、ポストドク、学生のなかに日本人がみあたらないのは残念です。ＣＡＳ－クリスパーシステムのもう少し専門的または詳しい日本語解説をみたい方は（１９）などを参照されるとよいでしょう。

ＣＡＳ－クリスパーシステム（ｓｇＲＮＡ＋Ｃａｓ）と挿入用のＤＮＡを使えば、正確な位置にＤＮＡを挿入することができます（図７）。といっても遺伝子をまるごと挿入できるわけではありません。ダウドナはその著書のなかで「ＣＲＩＳＰＲは私たちに生命の分子そのものを思うままに書き換える手段を与え」と述べていますが、それはちょっと大げさです。たとえば２種類のｓｇＲＮＡを用いてひとつの遺伝子を両端で切断してとりはずし、別の遺伝子と入れ換えるなどということはできません。ただ遺伝子に突然変異を導入する効率は飛躍的に進歩しました。

ＣＡＳ－クリスパーシステム（ｓｇＲＮＡ＋Ｃａｓ）を使ってＤＮＡを切断すると、２本鎖切断がおきるので、鋳型に依存しない通常不正確な修復機構によってＤＮＡがつながります。この結果しばしば遺伝情報のフレームシフト（横ずれ）によってコードが意味をなさなくなり、遺伝子の機能が失われます（図８）。

マウスの受精卵にＣＡＳ－クリスパーシステム（ｓｇＲＮＡ＋Ｃａｓ）を注入し、胚盤胞まで培養して仮親に育てさせると、狙った遺伝子が図８のような機構で無効化し、ノックアウトマウスを作成できます（図９）。また同時にオリゴＤＮＡを注入すると、そのオリゴＤＮＡをゲノムＤＮＡにとりこんだ動物ができます。たとえば点突然変異を持つ動物を作成できます（２０、図７）。

ある遺伝子に変異を導入して病原菌のターゲットにならないように遺伝子を改変するというのは、ＣＡＳ－クリスパーシステムの得意とするところです。うどんこ病に抵抗性のコムギなどは大きな成功でしょう（２１）。このシステムでは狙った特定の位置に正確に変異を導入できるので、Ｘ線・ガンマ線・化学物質などを使ってランダムに導入された変異などとはわけが違う、素性のはっきりした品種改良であり、これは私達が慎重さを確保した上で受け入れるべきものでしょう。

ダウドナの本（４）は非常によくまとめられていて、著者の頭の良さをうかがわせますが、同時にクリスパーのプロパガンダの本でもあります。クリスパーはもともとウィルスのＤＮＡを破壊するためのシステムであり、特定の配列を認識してＤＮＡを切断することはできますが、これを遺伝子編集というのはかなりおおげさな表現だと思います。クリスパーシステムが制限酵素のシステムと違うのは、ひとつはウィルスのＤＮＡ配列を記憶しておけるということ。もうひとつは制限酵素よりはるかに長い配列（２０塩基）を認識できるので、自分のＤＮＡを間違って切断する心配はない（したがってメチル化による保護は不要）ということです。

クリスパーシステムを用いた遺伝子治療を行なうには、プラスミドかウィルスにＣＡＳ－クリスパーを潜入させて、標的になる細胞にとりこませなければなりません。受精卵は大きいのでマイクロインジェクションで注入できますが、体細胞にはこのやり方は向いていません。このあたりがなかなか難しいところです。

参照

１）免疫不全症の遺伝子治療　ＡＡＳＪ
http://aasj.jp/news/watch/2281

２）遺伝子治療の現状と課題　ＰＭＤＡ科学委員会
https://www.pmda.go.jp/files/000156275.pdf

３）遺伝子治療の再来　北青山Ｄクリニック　がん遺伝子治療センター
https://cancergenetherapy-dclinic.info/knowledge/treatment/457/

４）ジェニファー・ダウドナ、サミュエル・スターンバーグ著　櫻井裕子訳　「クリスパー　究極の遺伝子編集技術の発見」文藝春秋社（２０１７）

５）http://morph.way-nifty.com/grey/2016/11/post-4728.html

６）http://morph.way-nifty.com/grey/2016/12/post-1ebc.html

７）Jack W. Szostak , Terry L. Orr-Weaver , Rodney J. Rothstein , Franklin W. Stahl., The double-strand-break repair model for recombination., Cell Vol. 33, Issue 1,  pp. 25-35 (1983)
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0092867483903318

８）黒沢綾、足立典隆　ヒト細胞における DNA 二本鎖切断の修復　Isotope News 　2014 年 5 月号　No.721、　pp. 8-14
https://www.jrias.or.jp/books/pdf/201405_TENBO_KUROSAWA_ADACHI.pdf#search=%27%E9%BB%92%E6%B2%A2%E7%B6%BE%E3%80%81%E8%B6%B3%E7%AB%8B%E5%85%B8%E9%9A%86%27

９）Philippe Rouet, Fatima Smih and Maria Jasin., Expression of a Site-Specific Endonuclease Stimulates Homologous Recombination in Mammalian Cells., Proc. NAS., Vol. 91, No. 13, pp. 6064-6068 (1994)
https://www.jstor.org/stable/2365114

１０）Ishino, Y., Shinagawa, H., Makino, K., Amemura, M., and Nakata, A. (1987) Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product. J. Bacteriol. 169, 5429-5433.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC213968/pdf/jbacter00202-0107.pdf

１１）Francisco J. M. Mojica, Cesar Díez-Villaseñor, Elena Soria, Guadalupe Juez., Biological significance of a family of regularly spaced repeats in the genomes of Archaea, Bacteria and mitochondria., Molec. Microbiol., vol. 36, Issue 1, pp. 244–246 (2000)
http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1046/j.1365-2958.2000.01838.x/full

１２）Jansen R, Embden JD, Gaastra W, Schouls LM.,  “Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes”. Mol Microbiol vol. 43 (6): pp. 1565–1575. (2002) doi:10.1046/j.1365-2958.2002.02839.x. PMID 11952905

１３）Bolotin A, Quinquis B, Sorokin A, Ehrlich SD., Clustered regularly interspaced short palindrome repeats (CRISPRs) have spacers of extrachromosomal origin., Microbiology. vol. 151(Pt 8): pp. 2551-2261. (2005)
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16079334

１４）Makarova KS, Grishin NV, Shabalina SA, Wolf YI, Koonin EV., A putative RNA-interference-based immune system in prokaryotes: computational analysis of the predicted enzymatic machinery, functional analogies with eukaryotic RNAi, and hypothetical mechanisms of action.,  Biology Direct, 1:7, (2006)  doi:10.1186/1745-6150-1-7
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16545108

１５）Rodolphe Barrangou et al., CRISPR Provides Acquired Resistance Against Viruses in Prokaryotes., Science vol. 315, Issue 5819, pp. 1709-1712 (2007)
DOI: 10.1126/science.1138140
http://science.sciencemag.org/content/315/5819/1709.long

１６）Brouns SJ et al., Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes., Science. vol. 321 (5891): pp. 960-964. (2008)  doi: 10.1126/science.1159689.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18703739

１７）Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, Hauer M, Doudna JA, Charpentier E., A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.,
Science vol. 337(6096):  pp. 816-821. (2012) 　doi: 10.1126/science.1225829. Epub 2012 Jun 28.

１８）http://rna.berkeley.edu/people.html

１９）新海暁男  CRISPR-Casシステムの構造と機能 生物物理 vol. 54（5），pp. 247-252（2014）
https://www.jstage.jst.go.jp/article/biophys/54/5/54_247/_pdf

２０）H Wang et al., One step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering., Cell vol. 153 pp. 910-918 (2013)
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3969854/

２１）Yanpeng Wang et al., Simultaneous editing of three homoeoalleles in hexaploid bread wheat confers heritable resistance  to powdery mildew., Nature Biotechnology, vol. 32, pp. 947-952  (2014 ) DOI: 10.1038/nbt.2969