やぶにらみ生物論４７： ＤＮＡ複製機構

「ＤＮＡの半保存的複製」のところで、１９５６年にアーサー・コーンバーグがＤＮＡの複製に関わる酵素ＤＮＡポリメラーゼを発見したことを述べました。世紀の大発見で、早くも１９５９年には彼にノーベル賞が授与されたくらいです。ところがそれから１０年も経った１９６９年、ＤＮＡポリメラーゼ活性を失った大腸菌の変異株を分離したという驚天動地の報告が Nature 誌に発表されました（１）。これはアーサー・コーンバーグの酵素がなくても大腸菌は増殖できることを意味します。大ピンチに陥ったアーサー・コーンバーグでしたが、その後始末は息子のトーマス・コーンバーグ(1948～)や、共同研究者のマルコム・ゲフター、広田幸敬(1930～1986) らによって迅速に行われました。

ゲフターとトーマス・コーンバーグはすぐに、大腸菌抽出液中にアーサーが発見した酵素（ pol I ) 以外に２種類のＤＮＡ合成酵素があることを発見し、それらを精製して pol II, pol III と命名しました。当時広田はＤＮＡ合成に関する温度感受性変異株を多数分離しており、ゲフターとトーマスは広田との共同研究によって、それらの温度感受性変異株と pol I のダブルミュータントを解析しました。そうすると pol II はどの株でも正常でしたが、ある株で pol III が強い温度感受性を示しました。この株では pol III が高温によって変性してしまったために、ＤＮＡが複製できなくなったのです（２）。このことは pol III がＤＮＡ複製を担う酵素であることを強く示唆しましたが、この酵素単独では複製能力が低く、ＤＮＡの複製はそんなに簡単にいくものではない、すなわち未知因子がかかわっていることも示唆されました。

閑話休題、トーマス・コーンバーグはチェリストでもあり、著名なピアニストのエマニュエル・アックスとベートーヴェンのチェロソナタを見事に演奏している様子が YouTube にアップされています（３）。広田幸敬先生の講義は聴いたことがあります。気さくで親しみやすい方との印象でした。「大腸菌の性因子に関する研究が、ちょっとした差でジャコブの手柄になって非常に残念だった」というようなことを話されていたことを記憶しています。若くして亡くなられたのは誠に残念でした。

さて、ではＤＮＡ複製にどんな因子がかかわっているのでしょうか？　この後アーサー・コーンバーグ研究室のすさまじい逆襲がはじまりました。多くの有能な若手研究者や学生を集めて、毎月複数の論文が出版されるほどの精力的な研究が進められました。しかもジェラルド・ハーウィッツの研究室も小うるさく参戦してきました。

彼らはまず試験管内無細胞系のＤＮＡ合成システムを完成させました。温度感受性変異株は高温下ではこのシステムでも当然ＤＮＡ合成はできません。これに正常株の抽出液を加えるとＤＮＡ合成は回復します。そこで正常株の抽出液をクロマトグラフィーなどによって幾つかの画分に分け、どの画分を加えると回復するか調べます（相補性テスト）。これを繰り返すことによって画分に含まれる成分は減少し、最終的にある精製された１種のタンパク質を加えると回復するということが判明します。別の株で同様な操作を行うと、また別種のＤＮＡ合成にかかわるタンパク質が精製されます。このような相補性テストで精製されたタンパク質はそれぞれ DnaX （X は任意のアルファベット）という名前が付けられ、それぞれの機能が解明されていきました。

なぜそんなに多くの因子が必要かということを考える上で、とりあえずＤＮＡポリメラーゼができることを図１に示します。ＤＮＡポリメラーゼは２重鎖と１重鎖の両方をの部分を持つＤＮＡにしかアクセスできません。しかも１重鎖（プライマー）の ３'OH が端でない方に露出している必要があります。プライマーの３'OH末端、 鋳型DNA、そしてデオキシヌクレオシド３リン酸が存在したとき、ＤＮＡポリメラーゼはデオキシヌクレオシド３リン酸からピロリン酸を切り離し、鋳型ＤＮＡに適合したデオキシヌクレオシド１リン酸の５'Ｐを３'ＯＨ末端に結合させて、ＤＮＡの鎖長をのばすことができます。これ以外のことはできません。鎖長を連続的に延長させるためには、もちろん dATP、dTTP、dGTP、dCTP の４種のデオキシヌクレオシド３リン酸が必要です。

ですから２重鎖だけのＤＮＡや１重鎖だけのＤＮＡがあってもこの酵素はＤＮＡ合成はできません。実際細胞内にはそのようなＤＮＡがまま存在するので（たとえば紫外線でＤＮＡが切れた場合とか、ウィルスが感染した場合とか）、意味のない、あるいは有害なＤＮＡをどんどん増やさないために、ＤＮＡポリメラーゼの機能が厳しく制約されていることには生理的意義があります。ただＤＮＡの損傷修復に用いられるＤＮＡポリメラーゼの中には、そのような制約を受けないものもあるようです。

図１ではＤＮＡになっていますが、プライマーは通常ＲＮＡです。ですからプライマーをつくるプライメースはＲＮＡポリメラーゼの１種です。ＲＮＡポリメラーゼは一般的にプライマーを必要としない酵素です。

図１から想像できるように、ＤＮＡの複製は DnaX タンパク質群やさまざまな酵素などのお膳立てや後始末があって、はじめて可能になるわけです。コーンバーグらが研究を続けていくと、pol III 以外の多くの種類のタンパク質や酵素がＤＮＡ合成にかかわっていることがわかってきました。ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ (pol III) 自体も、現在では多くのタンパク質が結合したＤＮＡポリメラーゼⅢホロ酵素のかたちで、ＤＮＡ複製を実行することがわかっています（図２　ウィキペディアより）。図２で pol III （コア酵素）は α と表示されています。

ＤＮＡは通常２重らせん構造をとっているので、上記したようにＤＮＡポリメラーゼがアクセスすることは不可能です。ですからまずＤＮＡの鎖をほどいて１本鎖の塩基側を露出させ、かつ酵素がアクセスするに十分なスペースをつくらなければいけません。

ＤＮＡはある決まった位置から複製が開始されます。開始位置領域には oriC という名前がつけられ、そこに大腸菌の場合８つの DnaA タンパク質の結合部位（ＴＴＡＴＣＣＡＣＡなど）が存在し、ここに DnaA が結合することによって、周辺に存在するＡＴリッチな部分の２重ラセンをほどき、DnaB と DnaC がアクセスできるようにします。DnaB (helicase) と DnaC は協力してＤＮＡの単鎖構造を安定化させ、ＤＮＡ複製のお膳立てをします（参照５、図３）。

こうして作られたアクセス可能な部位にＤＮＡ複製酵素がやってきて、すぐに複製を開始するかというと、そのような生物は見つかっていなくて、ほとんどの生物ではまずプライマーという短いＲＮＡ（生物によってはＤＮＡ）が作成され、そこを起点としてようやくＤＮＡ複製が開始されます（図１）。

大腸菌の場合、まず塩基の数にして１１±１のＲＮＡフラグメント（プライマー）がプライメース（primase）という１種のＲＮＡポリメラーゼによって作成され、その３’末からＤＮＡ複製がはじまります。

プライマーのＲＮＡフラグメントは後に別の酵素によって取り除かれます。この別の酵素というのが RNase H やアーサー・コーンバーグが発見したＤＮＡポリメラーゼ Ｉ（pol I）だとされています。このときには pol I はＲＮＡを分解する酵素としても働くという２面性を持った特異な酵素です。そうして取り除かれたあとの空白をＤＮＡで埋め戻し、最後に残された５'Ｐと３'ＯＨの断点をＤＮＡリガーゼ（DNA ligase）で接続してようやくＤＮＡ複製は完了します（５）。ＤＮＡの合成はＤＮＡ複製のときだけではなく、ＤＮＡがダメージをうけたときにも行われます。アーサー・コーンバーグの酵素はそのような際にはＤＮＡポリメラーゼとしても作用します。

大腸菌の場合ゲノムはサーキュラーで複製開始点はひとつですが（図３）、真核生物ではゲノムはリニアで多数の複製開始点があります（図４）。酵母で複製開始点を同定したデータをみますと、一定間隔であるわけでもないし、いっせいに複製が開始されるわけでもないようです（６）。ＤＮＡ複製が行われている部分のことを replication bubble とか replication eye などと呼ぶことがあります。

参照：

１）Paul de Lucia, John Cairns, Isolation of an E.Coli strain with a mutation affecting DNA polymerase. Nature vol.224, pp.1164-1166 (1969)

２）Malcolm L. Gefter, Yukinori Hirota, Thomas Kornberg, James A. Wechsler, and C. Barnoux. Analysis of DNA Polymerases II and III in Mutants of Escherichia coli Thermosensitive for DNA Synthesis. Proc Natl Acad Sci U S A. vol.68, pp.3150-3153 (1971)
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC389610/

３）https://www.youtube.com/watch?v=81rk7_I4-zY

４）http://www.sc.fukuoka-u.ac.jp/~bc1/Biochem/replicat.htm

５）Molecular Biology of the Gene. 7th edn., J.D.Watson et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (2008)

６）大阪大学大学院升方研究室　研究紹介
http://www.bio.sci.osaka-u.ac.jp/bio_web/lab_page/masukata/research/index.html